Caractérisation des souches de Naegleria fowleri à l’aide des marqueurs microsatellites

Résumé du document

Les amibes libres du genre Naegleria sont capables de mener une existence autonome dans le milieu extérieur et peuvent devenir dans certaines circonstances de redoutables agents pathogènes. Parmi elles, Naegleria fowleri est à l'origine chez l'homme d'une meningo-encéphalite d'évolution foudroyante. Les cas de contamination sont heureusement assez rares (près de 200 cas mortels ont été recensés dans le monde). Toutefois, N.fowleri étant une espèce thermotolérante, le risque de contamination devient non négligeable dans les eaux polluées thermiquement. C'est le cas des nombreuses centrales qui par l'échauffement des eaux de circuit de refroidissement favorisent le développement de N.fowleri.

Longtemps considérée comme une espèce très homogène, N.fowleri présente de façon surprenante une importante diversité moléculaire. La répartition mondiale de cinq variants majeurs de N.fowleri a été mise en évidence grâce à l'utilisation de marqueurs moléculaires (RAPD, ITS). La forte hétérogénéité observée chez N.fowleri, notamment dans les sites industriels français, nécessite une étude plus approfondie. Les microsatellites s'avèrent être un outil tout à fait approprié pour réaliser une étude des populations de N.fowleri.

Les microsatellites sont des séquences d'ADN réparties dans le génome, constituées par la répétition en tandem d'un motif de 1 à 5 paires de bases. En raison d'un fort taux de mutations, ces marqueurs moléculaires révèlent de nombreuses séquences polymorphes ou allèles au sein des différents variants. Quatre microsatellites NG 115, 42, 69 et 141 ont été définis au laboratoire et testés sur une trentaine de souches de N.fowleri. Seul le locus NG 141 présente un polymorphisme suffisamment important pour nous être informatif (12 allèles). Des allèles caractéristiques de chaque variant semblent confirmer leur répartition mondiale. Cependant il est nécessaire d'analyser un plus grand nombre de souches, de rechercher de nouveaux microsatellites hypervariables pour avoir des résultats significatifs à l'échelle environnementale. Ces données seront essentielles pour mieux comprendre la structure génétique de l'amibe pathogène et pour étudier son mode d'évolution dans l'environnement.

Extraits

[...] Cinq allèles respectivement à et 259 pb sont recensés dans notre échantillonnage de N.F. Locus NG-42 Figure 5. Profils allèliques du locus microsatellites NG 42 de quelques souches environnementales. Tableau 4.Bilan des profils observés pour le locus NG 42. Allèles caractéristiques d'un type de variant L'allèle 235 est présent exclusivement au sein du variant court. De même, l'allèle 229 est retrouvé uniquement dans les souches de Cattenom. Locus NG-69 Le locus NG 69 montre également une faible variabilité. Il est composé de motifs tri et dinucléotides répétés. [...]

[...] 1µl de bromure d'ethidium (BET) est ajouté au gel afin de visualiser les bandes d'ADN amplifiées sous lumière ultra-violette. Une échelle d'ADN de 100 pb est utilisée comme marqueur de taille. La migration s'effectue entre 90 et 120 volts. Isolement des locus microsatellites chez N.fowleri. Les locus microsatellites sont issus du clonage d'une banque partielle d'ADN de N.fowleri et ont été réalisés antérieurement au laboratoire en collaboration avec le DTAMB. Le protocole mis en place pour l'obtention de ces séquences répétées est indiqué en annexe 2. [...]

[...] En effet, les enzymes classiques de PCR utilisées rajoutent un nucléotide A en fin d'élongation, or la Taq polymérase utilisée n'en rajoute pas (car elle possède une activité exonucléasique en 3'). La différence d'une paire de bases est donc significative, contrairement à la Taq polymérase classique. Le fait que nous n'ayons pas d'individus homozygotes pour le locus NG-141 s'expliquerait par l'éventuelle insertion ou délétion d'une paire de bases dans une zone hors microsatellite. Les souches analysées seraient ainsi des homozygotes microsatellites. [...]

[...] Jadin J.B 1974. De la dispersion et du cycle des amibes libres. Ann. Soc. Belge. Med. Trop : 371- Lozano-Alarcon F., Bradley G., Houser B. and Visvesvara G Primary amebic meningoencephalitis due to Naegleria fowleri in a South American tapir. Vet Patol. 34:239- Marshall M., Naumovitz D., Ortega Y. [...]

[...] Origines et caractérisations des souches de l'environnement et de collection. identification des N.fowleri par analyse moléculaires. Les souches soulignées sont utilisées pour tester les 4 locus microsatellites. Les souches de collection 33 souches proviennent directement d'une collection établie au laboratoire. Elles ont toutes été précédemment identifiées par des marqueurs moléculaires au laboratoire de biologie cellulaire (RAPD, ITS). En effet, un certain nombre de souches de l'environnement n'ont pas pu être maintenues en culture du fait d'une très forte contamination dès le début des prélèvements à partir de la boite mère. [...]