Méthodes d'exploration

Résumé du document

Il s'agit du cours complet à propos des méthodes d'exploration en biologie cellulaire (cours de Mme. LEMARCHAND)

Extraits

[...] Méthode d'exploration des cellules Généralités Organites cellulaires Cellule : s'observe sous microscope Comporte des compartiments internes : Système endomembranaire (réticulum, noyau) Autres organites (mitochondries, lysosomes, vésicule) Comporte un squelette externe Peut ou non posséder : Des éléments externes mobiles (cils, flagelles) Des excroissances plus ou moins permanentes Cellules sont très complexes et leur ultrastructure est bien organisée Fonctions et vie cellulaire Grandes fonctions cellulaires : production mouvements des cellules et contact avec l'extérieur, usine chimique (fabrication + destruction de molécules), trafic intracellulaire/avec l'extérieur, communication (coordination avec d'autres cellules, réponse aux stimulus) Grands événements de la vie cellulaire : croissance, différenciation, reproduction, mort cellulaire Composition chimique cellulaire 4 éléments : N (peuvent former des chaînes) Eau : substance la + abondante (réaction ont lieu en majorité en milieu aqueux) Diffère bcp de la composition de la Terre Composition moléculaire Chimie de base semblable pour toutes les cellules Observation de la structure cellulaire par microscopie Microscopie photonique Pouvoir de résolution des microscopes Taille cellule : 10-20um Microscope photonique : 2mm à 200nm Microscope électronique : 2mm à 0,1nm Microscopie à contraste de phase Permet de voir des cellules vivantes = microscope à lumière blanche + système optique particulier Faible résolution (0,2um) Problème : on n'y voit pas grand-chose car cellule composée d'eau Préparation des échantillons Besoin de coupes Utilisation de fixateur pour les cellules non-vivantes En lumière blanche Analyse des tissus + organes par histologie colorants Peu spécifiques et peu sensibles donc développement de méthodes « marquages » utilisant la fluorescence Microscopie en fluorescence Similaire à la lumière blanche mais lumière fluorescente Visualise un groupe de molécule qui passerait inaperçue en lumière blanche Utilisée pour détecter des structures spécifiques dans les cellules + tissus (colorants spécifiques de site) Immunohistologie Utilisation d'un anticorps spécifique de la molécule d'intérêt couplé à un fluochrome Permet de détecter spécifiquement un type de protéine dans une cellule, d'étudier sa localisation, de la quantifier Vidéo microscopie Enregistrement par caméra et numérisation Utilisée pour reconstruire des images 3D Suivre les mouvements intracellulaires Se passe durant un instant t Microscopie confocale à balayage laser Microscopie classique auquel on a ajouté un laser, un système électronique + informatique, des composants optiques Gain en netteté Permet d'étudier la structure 3D, les doubles marquages (protéines/organites) Microscopie électronique Permet de voir des objets très petits Préparation spéciale Donne des images avec détails ou des représentations 3D Tomographie à électrons Microscope électronique + reconstitution 3D Echantillons congelés (azote liquide : congélation rapide [cellule ne sont pas au stade de cristal]) Permet de visualiser les organites en 3D et les rapports entre organites Isolement et culture des cellules Isolement à partir d'un tissu Digestion protéique pour dissocier les cellules de la matrice et entre elles Séparation des populations entre elles : centrifugation, attachement au plastique, tri par cytométrie en flux Mise en culture (au bout de quelques jours : cellules meurent sauf cellule tumorale et cellule souche) Tri cellulaire par cytométrie en flux (très rapide) Quantification de sous population selon plusieurs paramètres : nombre, volume, marquage fluorescent Tri de sous-populations cellulaire selon ces paramètres de haute pureté Facile à faire avec un échantillon en milieu liquide (pas possible dans les tissus [milieu solide] sauf avec la microdissection laser) Microdissection laser Permet de prélever quelques cellules dans une coupe de tissu Utile pour étudier un seul type cellulaire (épithélium, structure vasculaire) Prélever quelques cellules sur un tissu vivant Exploration moléculaire Fractionnement subcellulaire par ultracentrifugation Séparation des organites Grace à l'ultracentrifugation (centrifugation à très haute vitesse [60000tours min] et très longue[12-24h]) Sépare les différentes structures suivant leurs densités. [...]