Le principe du Western blot

Résumé du document

La migration des protéines chargées se fait au travers d'un gel de polyacrylamide.
Le gel est réalisé par polymérisation d'acrylamide et bisacrylamide. Les monomères d'acrylamide s'assemblent en longues chaînes et le bisacrylamide forme des pontages entre ces chaînes réalisant ainsi un maillage. Le pourcentage du gel dépend de la quantité de bisacrylamide ajoutée (...)

Extraits

[...] Le gel contient du SDS (Sodium DodécylSulfate) ainsi que du β-mercaptoéthanol. Il y a deux types de gel qui se différencie par leur concentration en polyacrylamide : - un gel de concentration situé au dessus du gel de séparation afin de permettre une entrée homogène de l'échantillon dans le gel de séparation - un gel de séparation permettant de séparer les protéines selon leur poids moléculaire (concentration choisie en fonction des protéines à séparer). Le gel de polyacrylamide Transfert sur membrane Révélation Les échantillons L'échantillon est un mélange de protéines bouillis en présence : - d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol, qui réduit les ponts disulfures. [...]

[...] Cette technique consiste d'abord en une séparation des protéines grâce à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis, un transfert sur membrane de nitrocellulose permet la révélation des protéines par différentes techniques. Cette méthode permet également d'évaluer la taille d'une protéine et sa concentration. La migration des protéines chargées se fait au travers d'un gel de polyacrylamide. Le gel est réalisé par polymérisation d'acrylamide et bisacrylamide. Les monomères d'acrylamide s'assemblent en longues chaînes et le bisacrylamide forme des pontages entre ces chaînes réalisant ainsi un maillage. Le pourcentage du gel dépend de la quantité de bisacrylamide ajoutée. La polymérisation ne peut avoir lieu qu'en présence de TEMED et persulfate d'ammonium. [...]

[...] Un courant électrique est appliqué. Les protéines chargées vont alors migrer de la cathode vers l'anode et vont se retrouver dans la membrane de nitrocellulose, en conservant l'organisation qu'elles avaient dans le gel. La fixation des protéines à la membrane se fait par des intéractions ioniques et hydrophobes. Blocage Il est nécessaire d'effectuer un blocage de la membrane de nitrocellulose avant d'ajouter les anticorps. Le blocage permet d'éviter la fixation des anticorps sur la membrane afin qu'ils se fixent exclusivement aux protéines étudiées. [...]

[...] La méthode la plus utilisée est l'immuno-marquage. Dans un premier temps, la membrane est mise dans une solution contenant un anticorps, appelé l'anticorps primaire, afin de former un complexe antigène-anticorps (l'antigène étant la protéine recherchée). Ce complexe doit être détecté : pour cela un deuxième anticorps est additionné : l'anticorps secondaire, qui détecte les emplacements où les anticorps primaires se sont liés aux protéines. Le plus souvent, cet anticorps secondaire est lié à une molécule : la HPR(HorseRaddish Peroxydase), dont l'activité enzymatique sera detectée par chimiluminescence, qui permettra d'observer les complexes. [...]