Hybridation moléculaire, sondes et marquages de sondes

Thèmes abordés

Hybridation moléculaire, appariemment, sonde, acide nucléique, ADN

Résumé du document

Appariemment par complémentarité de bases de 2 séquences nucléotidiques.
ADN/ADN ADN/ARN ARN/ARN chaines anti-parallèles.
Une des 2 séquences sert de sonde.
Sonde :
- séquence d'au moins 15 nucléotides,
- complémentaire d'une séquence ADN ou ARN avec laquelle elle s'hybride de façon stable et
spécifique.
Sonde doit être marquée à moins que l'acide nucléique à étudier ne le soit:
- porte un élément distinctif = marqueur,
- repérage de l'hybride.

Extraits

[...] Mode opératoire : dans un tube à essai on met en présence tous les éléments à utiliser pour le bon déroulement de la réaction. On laisse incuber à environ pendant 2h. On arrête la réaction par un tampon stop. Il contient un chélateur d'ion. Purification de la sonde, filtration sur gel permettant de séparer la sonde du reste. Utilisation des sondes obtenues par Nick translation - dans différents types d'hybridation : hybridation de Southern blots hybridation de nothern blots hybridation de dot blots 2.2 ) Random Priming Multi-amorçage au hasard qui permet d'incorporer un nucléotide modifié dans une sonde ADN. [...]

[...] Elle utilise : - ADN double brin - DNase faible concentration, basse température - ADN polymérase I - 4 dNTP dans l'un est modifié (Schéma de la Nick translation). La DNase I clive que quelques liaisons, au niveau de ces cassures l'ADNpol I réalise une activité exonucléasique qui s'exerce quand l'extrémité est bien appariée. Elle peut donc agir au niveau de ces cassures qui permet de dégrader des fragments générés par la DNase I. Elle a aussi des conditions pour exercer cette activité c'est à dire des petites amorces avec des extremités 3'OH libres. Sans ADN double brin, ADNpol I n'aurait pas pu fonctionner. [...]

[...] Une des 2 séquences sert de sonde. Sonde : - séquence d'au moins 15 nucléotides - complémentaire d'une séquence ADN ou ARN avec laquelle elle s'hybride de façon stable et spécifique Sonde doit être marquée à moins que l'acide nucléique à étudier ne le soit. - porte un élément distinctif = marqueur - repérage de l'hybride ADN* Hyb. Marqueur : est un isotope radioactif sonde radioactive n'est pas un isotope radioactif sonde froide ADN - ADN* Marqueur = isotope radioactif, très souvent 32P, le rayonnement émis permet l'impression d'un film photographique. [...]

[...] Ils servent d'amorce aux fragments de Klenow. (Schéma p.7) - séparation des deux brins de la sonde - addition : - cocktail d'oligonucléotides - fragment de Klenow - dNTP dont l'un est radioactif ou porteur d'un marqueur final 2.3 ) Marquage d'oligonucléotides Synthèse organique chaine d'ADN sb = oligodésoxyribonucléotide (15 à 20 nucléotides) Oligonicléotide peut servir de sonde. Marquage à l'extrémité grâce à la T4 polynucléotide kinase en présence d'ATP radioactif marqué en gamma. Il y a transfert du phosphate en gamma d'un ATP sur hydroxyle d'un polynucléotide ) Marquage des ribosondes Sondes ARN, généralement marquées au 32P (p.8). [...]

[...] Hybridation dépend de la complexité des séquences : plus il y a de séquences différentes dans le mélange à hybrider avec la sonde, plus la probabilité de rencontre sonde/séq complémentaire est faible, plus le temps d'hybridation sera long. Hybridation dépend de la présence de formamide. La formamide fait diminuer la Tm, donc on a une diminution de la température d'hybridation, en présence de 50% de formamide. Hybridation dépend de la présence de sulfate de dextran vitesse d'hyb augmente en présence de sulfate de dextran. [...]