Guide d'utilisation Microscopes à fluorescence

Résumé du document

Guide simplifié de l'utilisation des microscopes à fluorescence, en allant du système le plus simple au plus compliqué. Vous trouverez dans ce document des indications sur : -comment marchent les différents microscopes- quand utiliser tel ou tel microscope- quelles sont les erreurs à éviter, avec une explication sur les points forts/faibles de chaque microscopes

Extraits

[...] La préparation des échantillons est simple, mais les images sont assez compliquées à analyser. STED (Stimulated Emission-Depletion): On entre dans la super-résolution, les échantillons demandent un peu plus de « qualité » (donc de mise au point) pour acquérir une image exploitable. Le microscope est un peu plus difficile à utiliser par rapport aux microscopes précédents. Cette technologie est particulièrement adaptée pour imager les signaux ponctiformes. On peut imager le vivant, mais dans un temps assez réduit car on a une forte photo-toxicité à moyen terme. [...]

[...] Il est possible d'effectuer des acquisitions en STED 2D ou 3D. Alors que la fonction 2D classique utilise un seul laser qui illumine le point d'intérêt sur l'échantillon, la fonction 3D va dupliquer le laser initial en deux (et donc diminuer leurs puissances). Il faut donc toujours garder à l'esprit que l'augmentation de la résolution en Z va limiter un peu plus la résolution en il faut trouver un équilibre. Par rapport à ce qui a été dit dans le paragraphe précédent, il est impossible de faire du STED 3D sur de l'endogène, on n'a plus assez de puissance laser. [...]

[...] Confocal équipé de la technologie Airyscan (vivant/fixé) La technologie Airyscan est utilisée pour augmenter la résolution d'une acquisition confocale classique. Cela passe premièrement par une augmentation de la puissance laser du confocal. L'Airyscan est en réalité une déconvolution appliquée directement sur l'image lors de l'acquisition. Cela soulève donc un point essentiel pour acquérir de bonnes images en Airyscan : Il ne faut absolument pas de saturation lors de l'acquisition Si on a de la saturation, la déconvolution va prendre ce signal ectopique pour un signal « moyen » et va donc effectuer la déconvolution suppression) sur le signal spécifique. [...]

[...] Il est donc recommandé pour l'analyse de colocalisations par exemple. Après une acquisition d'image en Airyscan (donc déjà déconvoluée), on peut effectuer (sous Zen directement) un « processing » qui va donner une excellente résolution. Mais cela équivaut à re-déconvoluer une image déjà déconvoluée, donc il faut rester vigilant et bien paramétrer ce « processing » afin de ne pas supprimer le signal qui nous intéresse. Point technique : Alors qu'il est commun d'amplifier les paramètres « frame-rate » et « averaging » lors d'une acquisition au confocal classique pour augmenter la résolution (au détriment de la vitesse d'acquisition). [...]

[...] C'est le microscope qui possède la meilleure résolution temporelle actuellement. Un inconvénient de ce dispositif est qu'il faut un signal fort dans notre échantillon. Donc de la même manière, il faut faire attention si on travaille sur l'endogène. Confocal équipé de la technologie de super résolution STED (vivant/fixé) Avec le STED, on excite un fluorophore avec un laser particulier qui va l'exciter, puis effectuer une restriction directement au niveau du signal émis. Pour cela, le laser utilisé est un laser de déplétion qui va affiner le signal d'émission, ce n'est théoriquement pas un laser de bleaching Par conséquent, les fluorophores déplétés plutôt qu'être grillés retournent au « ground state » et sont en théorie ré-excitables ultérieurement (cf. [...]