Diverses techniques d’étude des acides nucléiques

Thèmes abordés

Acides nucléiques, Polymerase Chain Reaction, séquençage, clonage, CGH array

Résumé du document

Après action d'une enzyme de restriction, l'ADN est digéré en de nombreux fragments qui seront soumis à une électrophorèse. Ensuite ils migreront dans un gel d'agarose de haut en bas en fonction inverse de leur taille et seront transférés sur une membrane de nylon. Cette dernière sera mise à incuber dans un sac qui contient des sondes connues complémentaires aux fragments d'ADN qu'on recherche. Après lavage, la membrane est mise au contact d'un film radiographique. On finit par révéler le film, les traces correspondent aux sondes marquées qui se sont hybridées aux fragments d'ADN. La taille correspond à celle des fragments et non aux sondes.

Extraits

[...] Problématique : on part de milliard de cellules. Toutes ne sont pas transformées. Comment isoler le clone de cellule qui contient l'ADN d'intérêt? Pour ce faire, on apporte des caractéristiques supplémentaires aux vecteurs : ils possèdent des gènes spécifiques permettant la sélection du clone bactérien transformé
-un gène de résistance à un antibiotique pour sélectionner les cellules ayant intégré le plasmide (les cellules qui n'auront pas le plasmide ne pourront pas pousser)
-un site d'insertion du gène d'intérêt. Ce site est situé à l'intérieur du gène codant pour une enzyme la ß-galactosidase qui transforme le X-Gal en un produit donnant une coloration bleue. [...]

[...] Ultérieurement, on purifiera le plasmide puis on récupérera l'ADN d'intérêt. CGH array puces à hybridation génomique comparative) On utilise des puces sur lesquelles sont greffés soit des sondes d'ADN, soit des fragments de nucléotides ( 144.000 ) représentant la totalité du génome. On hybride le génome que l'on souhaite tester et il est préalablement marqué par un fluorochrome. On compare avec un génome témoin marqué par un autre fluorochrome. Les puces CGH mettent en évidence les microdélétions et les amplifications dans le génome. [...]

[...] Après lavage, la membrane est mise au contact d'un film radiographique. On finit par révéler le film, les traces correspondent aux sondes marquées qui se sont hybridées aux fragments d'ADN. La taille correspond à celle des fragments et non aux sondes. Le Northern Blot est une technique équivalente mais qui permet l'étude de l'ARN. PCR (=Polymerase Chain Reaction) Elle permet l'amplification sélective d'un fragment d'ADN déterminé (100 à 20000 bp) afin de pouvoir l'étudier. Le fragment à amplifier est borné par des amorces dont la séquence est connue. [...]

[...] NB : chez l'Homme, les chromosomes sont en paire. On amplifie donc le fragment d'intérêt situé sur le chromosome paternel et le chromosome maternel. Les amorces sont placées du côté 3' du fragment d'ADN à amplifier. Comme mentionné dans le paragraphe sur les polymérases, la Taq polymérase va lire la séquence d'ADN de 3' en et ajouter les nucléotides à l'amorce (qui est complémentaire à l'ADN) de 5' de l'amorce en 3'. Séquençage Le séquençage de l'ADN utilise le plus souvent la méthode de SANGER. [...]

[...] Ainsi si on souhaite retrouver la séquence de l'amorce, on lit la séquence nucléotidique du bas vers le haut. Pour retrouver la séquence du brin matriciel dans le sens 5' 3', on prend la liste des nucléotides du haut vers le bas que l'on traduit par complémentarité un par un. Clonage En biologie moléculaire, le clonage permet d'isoler un fragment d'ADN et le multiplier à l'identique dans une cellule (procaryote ou eucaryote). Les expériences de Dawson et Avery ont permis de déduire plusieurs principes Lorsqu'on ajoute de l'ADN dans des cellules en culture (bactéries), l'acide nucléique pénètre dans la cellule. [...]