Transformation bactérienne : induction bactérienne du gène de la ?-galactosidase

Thèmes abordés

Transformation bactérie

Résumé du document

La transformation est un transfert génétique au cours duquel de l'ADN bicaténaire, libre, nu et en solution est introduit dans une bactérie réceptrice, puis intégré au chromosome. Cette transformation peut être naturelle ou artificielle. La transformation artificielle est d'un usage courant dans les laboratoires de biologie moléculaire.

Extraits

[...] Il est donc impossible d'en tirer quelque chose. Les boites contenant les bactéries rendues compétentes à l'aide de CaCl2 ne sont pas contaminées. Les bactéries ayant intégré le plasmide P1 sont bleues et les bactéries ayant intégré le plasmide P2 sont blanches. On en déduit donc que P1 ne contient pas l'insert et que P2 contient l'insert. Efficacité de transformation de P1 = x x = 17038 UFC par ng de plasmide. Efficacité de transformation de P2 = x x = 14138 UFC par ng de plasmide. [...]

[...] Cette transformation peut être naturelle ou artificielle. La transformation artificielle est d'un usage courant dans les laboratoires de biologie moléculaire. Elle a pour but de transférer diverses molécules d'ADN à des bactéries non naturellement transformables telles qu'Escherichia coli. La bactérie réceptrice est alors utilisée pour amplifier l'ADN exogène qui est souvent un plasmide. Au cours de ce TP, nous avons utilisé le plasmide pT7blue-3 qui possède : - le gène LacZ - un site de coupure EcoRI (sur le gène LacZ) - une Origine de réplication - un site de résistance à l'ampicilline On dispose de 2 plasmides pT7blue-3 : l'un contenant l'insert et l'autre non. [...]

[...] Les résultats que nous avons obtenus sont étonnants. Au lieu d'obtenir pour P1 coupé un fragment et pour P2 coupé deux fragments, on obtient deux fragments pour P1 coupé et P2 coupé. Peut-être que les cultures bactériennes utilisées lors de préparation des minipréparations contenaient-elles que des plasmides P2 ? Conclusion : Le plasmide qui contient l'insert est P2. Nous avons pu le déterminer en réalisant une transformation artificielle des 2 plasmides et en réalisant une électrophorèse de ces plasmides digérés ou non. [...]

[...] On a utilisé deux techniques : - l'une utilisant du chlorure de calcium : Le CaCl2 crée des pores dans la paroi des bactéries afin d'y laisser pénétrer les plasmides. - L'autre utilisant le polyéthylène glycol : le PEG Transformation bactérienne Un choc thermique facilite l'entrée de l'ADN plasmidique dans les cellules d'E. coli rendues artificiellement compétentes. Les cellules traitées sont cultivées dans un milieu liquide non sélectif afin d'obtenir la synthèse de la protéine qui confère la résistance à l'antibiotique puis elles sont sélectionnées sur un milieu LB solide additionné d'antibiotique afin d'identifier les cellules qui contiennent l'ADN plasmidique. [...]

[...] L'ADN chromosomique des bactéries est alors entrainé avec ce précipité alors que les plasmides y échappent. Digestion enzymatique (même principe que précédemment) Electrophorèse (même principe que précédemment) Résultats et discussion Les bactéries que l'on a transformées sont étalées sur un milieu LB, sur des milieux LB contenant de l'ampicilline et sur des milieu LB contenant de l'ampicilline, X-Gal IPTG. Il faut ensuite pouvoir sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide recombinant. Il est possible d'utiliser le système de sélection de l'opéron lactose : le plasmide possède le gène lac Z qui code pour la β- galactosidase dans l'opéron lactose, l'insertion du fragment d'ADN étranger aboutit à l'inactivation du gène. [...]