Réalisation d'un caryotype humain et murin

Thèmes abordés

Caryotype, humain, murin, banding, génétique, chromosomes

Résumé du document

Le caryotype permet, en premier lieu, l'étude de la constitution chromosomique d'un individu, puis la mise en évidence de remaniements génétiques faisant l'objet de pathologies. Il peut être réalisé sur lymphocytes sanguins, cellules tumorales (dont moelle osseuse), fibroblastes, cellules germinales, cellules amniotiques...
Il permet ainsi de classer les chromosomes par paires d'homologues, suivant la position du centromère ainsi que par ordre de taille décroissante, notamment pour déceler des maladies d'origine chromosomique comme la trisomie 21 (via un diagnostic prénatal) mais aussi en cas d'ambiguïté sexuelle chez l'enfant.
C'est en 1880 que la structure des chromosomes a été découverte par Flemming, suite à l'étude au microscope des noyaux des cellules. Le terme chromosome « corps coloré » désigne les organites qui fixent facilement les colorants basiques. Le nombre de chromosomes est caractéristique des différentes espèces. Chez la majorité des procaryotes, il n'y a qu'un seul et unique chromosome, en revanche les eucaryotes en possèdent une grande variété, avec un nombre cependant très variable.
La technique de réalisation d'un caryotype consiste à mettre des cellules en culture et à bloquer la mitose en métaphase par l'ajout de colchicine. En métaphase, les chromosomes se condensent et se positionnent à l'équateur de la cellule grâce à la polymérisation de microtubules attachés aux deux kinétochores. La colchicine inhibe la formation des microtubules et empêche la migration des chromosomes. Un choc hypotonique est réalisé pour disperser les chromosomes, et est suivi d'une étape de fixation. Les chromosomes peuvent être colorés à l'aide de différentes techniques de marquage tel que le banding G avec le Giemsa.
Le but de ce TP est donc d'observer deux types de caryotypes, traduisant deux espèces différentes : un murin et l'autre humain, au microscope optique afin de déterminer la taille, la forme ainsi que le nombre de chromosomes.

Extraits

[...] II Préparation des solutions Un caryotype, comme expliqué précédemment, se divise en plusieurs étapes qui seront expliquées ultérieurement. La préparation des solutions est la priorité afin de procéder le plus rapidement possible sans altération du produit final. Culture cellulaire Arrêt des mitoses en métaphase Choc hypotonique Fixation Etalement Choc hypotonique Le choc hypotonique permet l'étalement des chromosomes. La solution hypotonique provoque une entrée d'eau dans la cellule qui va gonfler et se fragiliser. Lorsque la goutte de solution contenant les cellules sera déposée sur la lame les membranes plasmiques des cellules se briseront ce qui libera les noyaux des cellules et les chromosomes des cellules en mitose stoppée à la métaphase. [...]

[...] Le volume final de la solution de fixation doit être de 12 ml. Il faut 3 volumes d'éthanol pour 1 volume d'acide acétique. = x 3 = 9 ml d'éthanol 12 9 = 3 ml d'acide acétique Etalement L'étalement se fait à l'aide d'une solution contenant de la Trypsine (endoprotéase) qui permet en collaboration avec le Giemsa, l'apparition de bandes G sur l'ADN et donc l'identification précise des chromosomes. Les bains successifs dans lesquels les lames seront placées correspondent à : Trypsine PBS Giemsa 15s 5s 5mn - H2O H2O 5s 5s III Résultats Discussion L'observation des caryotypes se fait au microscope optique, au grossissement x1000, après coloration au Giemsa. [...]

[...] Les deux figures ci-dessous représentent les caryotypes humains observés lors de la séance de TP. Chromosomes libres Noyaux en mitose Figures 1 et 2 : Caryotypes humains Caryotype murin Concernant ce caryotype, on peut observer seulement 40 chromosomes, en comparaison aux 46 humains. De même que pour le caryotype précédent, les cellules et noyaux éclatés ont permis de libérer les chromosomes, ceux-ci étant dispersés aléatoirement. Des noyaux n'étant pas en métaphase, même après l'action de la colchicine, sont visibles sur l'ensemble de la lame. [...]

[...] En effet, ils sont retrouvés sous 3 formes : Des chromosomes acrocentriques : ils possèdent un centromère situé à une extrémité du chromosome. Chez l'homme, les bras courts des chromosomes acrocentriques sont de toute petite taille et ne comporte que des gènes codant pour l'ARN ribosomial. Les chromosomes et 22 humains sont des exemples de chromosomes acrocentriques. Des chromosomes sub métacentriques : ils possèdent un centromère décalé vers l'une des extrémités du chromosome. Ce décalage du centromère induit la présence de bras courts et de bras longs. Des chromosomes métacentriques : leur centromère est bien centré au milieu du chromosome. [...]

[...] Chez la majorité des procaryotes, il n'y a qu'un seul et unique chromosome, en revanche les eucaryotes en possèdent une grande variété, avec un nombre cependant très variable. La technique de réalisation d'un caryotype consiste à mettre des cellules en culture et à bloquer la mitose en métaphase par l'ajout de colchicine. En métaphase, les chromosomes se condensent et se positionnent à l'équateur de la cellule grâce à la polymérisation de microtubules attachés aux deux kinétochores. La colchicine inhibe la formation des microtubules et empêche la migration des chromosomes. [...]