PCR : réaction en chaîne par polymérase (Polymerase Chain Reaction)

Résumé du document

Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...
La technique de PCR permet de réaliser cet exploit en multipliant spécifiquement le segment d'ADN d'intérêt (aussi appelé ADN cible).

La PCR utilise de manière répétitive, l'une des propriétés des ADN polymérases : celle de ne pouvoir synthétiser un brin complémentaire d'ADN qu'à partir d'une amorce.
Au cours de la réaction PCR :
- une série de réactions permettant la réplication d'une matrice d'ADN double brin est répétée en boucle.
- les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l'amplification est donc exponentielle.

La PCR permet de copier (à partir de l'ADN chromosomique et via une réaction enzymatique simple, n'importe quelle séquence d'ADN) et de l'amplifier plus d'un million de fois jusqu'à il devient la molécule d'ADN majoritaire dans le milieu réactionnel.
Finalement, On obtient suffisamment d'ADN pour pouvoir manipuler le gène amplifié ou en faire des analyses détaillées.

Extraits

[...] C'est un produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques. Lorsqu‘il est intercalé, cette molécule présente une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 300 nm). Les produits d'amplification sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BET. La vitesse de migration étant dépendante de la masse moléculaire, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des Amplicons pourront être vérifiées. [...]

[...] Le but de la RACE-PCR tient dans l'isolement des fins de gènes. C'est une technique dérivée de la RT-PCR. La technique de RACE-PCR permet de dépasser les limitations de la PCR par différents procédés. L'un des plus utilisés est: Smart Race-PCR (Clontech) Principe: une enzyme miracle pour combler la méconnaissance d'une deuxième séquence d'amorçage.Il s'agit d'une R.T. (Reverse transcriptase) particulière, qui, après avoir accompli son activité de polymérase, met en place une activité intrinsèque de transférase terminale en ajoutant des résidus, principalement dC, à l'extrémité du premier brin d'ADNc. [...]

[...] Cette procédure permet le plus souvent d'obtenir l'amplification spécifique d'un seul fragment. Principe Image BG_54_PICT.jpg Mécanisme de la PCR Nichée PCR Asymétrique Principe: C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5à 10derniers cycles. PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL logo PCR en temps réel La PCR en temps réel(Real-time PCR) est révolution dans l'utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d'ADN polymérisé à chaque cycle grâce à un marqueur fluorescent. [...]

[...] Ceci a permis d'améliorer notre compréhension des mécanismes de développement du cancer. logo • Les sciences médico-légales. Parce qu'elle permet d'amplifier des séquences répétitives, la PCR peut être utilisée pour identifier des individus à partir d'échantillons de leur ADN. On utilise ceci pour relier des individus à des échantillons d'ADN prélevés sur la scène d'un crime. L'analyse des séquences variables est également utilisée pour associer des donneurs d'organes avec des receveurs et en anthropologie pour étudier les origines des « races » humaines. [...]

[...] LES APPLICATIONS INDIRECTES Il s'agit de recherches effectuées sur les produits d'amplification qui servent de base à l'application d'une seconde technique : le séquençage direct ou des techniques susceptibles de faire apparaître une différence de comportement entre ADN normal et ADN « muté ». Cela permet, par exemple, la mise en évidence et la caractérisation de mutations inconnues. logo CONCLUSION Une simple enzyme qui résiste à la chaleur à l'origine d'un bond prodigieux des sciences de la vie. Auparavant, l'amplification génique, une telle opération nécessitait impérativement le clonage de la séquence, son isolement, son amplification dans une cellule hôte et sa purification. [...]