Extraction d'ADN des cellules eucaryotes

Résumé du document

Extraire l'ADN d'une cellule n'est pas évident car ce dernier est protégé par les parois et membranes de nature Lipoprotéiques et polysaccharidiques, qu'il faut dissoudre ou écarter pour pénétrer dans la cellule. Si la traversée du cytoplasme ne pose pas de problème, il faut ensuite pénétrer dans le noyau de la cellule. Mais l'ADN n'est pas isolé. Il est entouré par des protéines qui doivent être éliminées. On appelle ce mécanisme la purification de l'ADN.
Enfin, au cours de l‘extraction, la solution dans laquelle est plongé l'ADN contient également toutes les substances qui ont servi à l'extraire. Il faut donc trouver une méthode pour séparer l'ADN du milieu liquide(précipitation ou chromatographie). Ce n'est qu'au terme de cette étape que nous aurons isolé l'ADN. En fonction de la nature et de la densité de la cellule, la procédure est plus ou moins complexe ou chère.

L'extraction d'ADN à partir de cellules procaryotes présente l'avantage de ne pas posséder d'enveloppe nucléaire : l'ADN est donc facilement accessible.
Le problème majeur consiste à obtenir une concentration suffisante de cellules (une culture stérile de plusieurs jours). Par contre, l'extraction d'ADN à partir de cellules eucaryotes peut se faire en quelques heures.

Extraits

[...] Enfin, l'ADN est repris dans 200µl d'eau UP et stocké à 4°C. Autre protocole pour les plantes Préchauffer le tampon d'extraction / CTAB (polyvinylpyrrolidone) M NaCl mM EDTA mM Tris-HCl (pH et / ß-mercaptoéthanol (ajouté juste avant l'utilisation sous hôte). dans un bain-marie à 60 ° C Broyer les échantillons de feuilles dans de l'azote liquide ; ajouter au broyat 7,5 ml de CTAB par g de jeunes feuilles broyées . Ajouter 10-15 mg/g du charbon actif et 375 µl/g de ß-mercaptoéthanol sous hotte et bien vortexer . [...]

[...] Votre salive est pleine de cellules. Notez soigneusement le niveau de salive: c'est important. Rajoutez le double de volume de Tampon de lyse (1c à café de shampoing, 1/4 c à café de sel ml de l'eau froide et 1 c à café de bicarbonate de soude). Bouchez le bout du tube avec le doigt et remuez vigoureusement pendant 2 minutes. Ajouter d'éthanol glacé ( à 90° à Volume égal) longuement sur la paroi du tube: il faut mélanger le moins possible. [...]

[...] Extraction d'ADN des fossiles Depuis une dizaine d'années, l'extraction et l'amplification de l'ADN à partir de restes anciens de plantes et d'animaux ont été rendues possibles grâce au développement des techniques de la biologie moléculaire. L'ADN peut être préservé dans différents types de tissus. Facteurs influençant la conservation: Des facteurs physico-chimiques environnementaux température, humidité, pression) . Le facteur temps ne semble pas être un paramètre fondamental. Les dégradations chimiques et enzymatiques sont ralenties lorsque les températures sont faibles – l'idéal étant la congélation – ou dans des milieux anaérobies, désertiques secs. [...]

[...] Centrifugation 20 minutes. Récupérer la phase aqueuse puis ajout un volume égal de chloroforme Centrifugation 15 min puis récupération de la phase aqueuse par l'ajout d'un double volume d'éthanol pour précipiter l'ADN. Reprendre le précipité dans 500µl de tampon de lyse. Addition de165µl de NaCl pour concentrer . Ajout de 665µl de chloroforme puis centrifugation 10 minutes. Récupérer la phase aqueuse et précipiter l'ADN avec 2 volumes d'éthanol absolu. Centrifugation de 10 minutes Récupérer, laver le culot 3 fois à l'éthanol 70% glacial. [...]

[...] culot est repris dans 500 µl de TE 1x pour subir un lavage au CI puis précipité à l'aide d'acétate de sodium et d'éthanol 100%. Après la centrifugation, le culot est directement mis à sécher et repris dans 100µl d'eau UP. Extraction d'ADN des champignons Broyage du mycélium dans de l'azote liquide à l'aide d'un pilon. Addition de 500µl de tampon d'extraction au CTAB ( 0.7 M NaCl, 10mM EDTA mM Tris-HCl [pH β-mercaptoethanol, 1%CTAB). Incubation à 65°C / 30 à 60 minutes Addition de 500 µl de SEVAG (chloroforme- alcool isoamylique 24:1 et agitation douce /30 min. Centrifugation à 15000g /10 minutes. [...]