Le silencing chez A.thaliana

Résumé du document

En 1990, Jorgensen, qui cherche à intensifier la coloration de pétunias, fabrique des plantes qui portent un transgene codant pour un pigment homologue au gène endogène. Contrairement à ce qu'il attendait, il se rend compte que les plantes ainsi obtenues n'ont pas une coloration plus intense, mais qu'au contraire celle-ci est fortement atténuée voire totalement abolie.
Sans le savoir, il vient de mettre en évidence un phénomène qui a depuis pris une très grande importance dans le monde de la biologie, a tel point qu'elle
est a l'origine du dernier prix Nobel décerné : le siRNA (pour small interference RNA)
Bien que depuis, des progrès importants aient étés réalisés dans la compréhension de ce phénomène, le TP dont les résultats seront présentés par la suite s'inspire d'une expérience historique (Elmayan et al. 1998).
A cette époque, le siRNA n'était pas aussi largement admis qu'aujourd'hui, le premier but de ces expériences est donc de le mettre en évidence, c'est-àdire de montrer que l'augmentation du nombre de copies de gènes homologues dans le génome d'une plante mène à leur inactivation.
De plus l'analyse des transcrits dans les plantes subissant ce silencing révèle un phénomène étonnant : dans certains cas, l'extinction d'un gène s'accompagne d'une disparition de l'accumulation de ses ARNm, alors que dans d'autres, ces ARNm restent détectables dans le cytoplasme

Extraits

[...] RESULTATS TEST DE RESISTANCE A LA KANAMYCINE Les plantules cultivées in vitro pendant une semaine ne donnent pas de résultats concluants quant à la présence de l'insert dans ces lignées (notre binôme a étudié les lignées L1 et L2). Chacune des lignées ensemencées sur un milieu avec ou sans kanamycine semble avoir germé. En fait, on n'observe que des cotylédons verts et l'on ne peut conclure sur la présence de l'insert (résistance à la kanamycine) puisque toutes les graines éclosent sur le milieu MG jusqu'à ce stade deux cotylédons et que les cotylédons n'ont pas pris de couleur blanche sur milieu MG+kanamycine, qui témoignerait de l'éventuelle sensibilité de la plantule à la kanamycine. [...]

[...] -PCR3 (pour transfert sur membrane et hybridati Idem que la PCR2 (une uidA et une P35), mais à 25 cycles, ce qui permet également de confirmer la transformation (comme la PCR2), mais aussi d'estimer le nombre de copies insérées dans chaque lignée. Les amorces et contrôles utilisés sont les mêmes que pour la PCR2. Nous avons ensuite fait migrer ces produits de PCR sur gel d'Agarose. Puis, nous avons traité ce gel à la soude afin de dénaturer les ADN double brins. Transfert sur membrane : Nous avons ensuite fait le montage nécessaire au transfert des produits de la PCR sur membrane de nylon, et nous avons laissé transférer toute la nuit. [...]

[...] Ces résultats lèvent l'ambiguïté sur L1, qui n'est donc pas soumise au silencing, et sert dont de point de repère pour l'étude des autres lignées. A partir de là, on déduit que L2 possède un gène uidA hyperméthylé au niveau de la séquence codante mais pas de son promoteur, et que L3 voit l'ensemble de son gène uidA hyperméthylé. Si seule la séquence codante d'un gène est méthylée, alors ce gène est soumis au PTGS, ce qui confirme ce que nous supposions dans le cas de L2. [...]

[...] Nous avons mis la même quantité de chaque extrait dans 3mL de Bradford, puis nous avons mesuré la densité optique de cette cuve. Nous avons ensuite reporté sur une courbe étalon obtenue grâce à une gamme de sérumalbumine bovine ce qui nous a permis d'obtenir la concentration protéique correspondant à la DO observée. - Dosage fluorimétrique de l'activité GUS : Pour cela, nous avons mesuré l'activié B-Glucuronidase pour les extraits protéiques de ces quatre lignées en ajoutant le substrat de l'enzyme, le MUG. [...]

[...] Ordre : uidA L1 L2 L3 L4 + - /ladder/ P35S L1 L2 L3 L4 + Obs. : A ce stade de l'amplification, seuls les contrôles positifs (ADN en grande quantité) sont fortement amplifiés. Les fluorescences différentes apparaissants pour les bandes correspondant au gène uidA (partie gauche du gel) témoignent d'une insertion en plus grand nombre de l'ADNT dans L3, puis dans L2 et enfin dans L1 qui possède l'insert en plus petite quantité. Rien n'apparaît pour L4 dans ce cas, ni pour aucune des lignées pour les produits de PCR P35S. [...]