Régulation de la biosynthèse de la Fibronectine par une hormone glucocorticoïde dans une lignée cellulaire tumorale colique de rat

Résumé du document

Les hormones glucocorticoïdes régulent l'expression de gènes spécifiques en se liant à des récepteurs solubles spécifiques dans le cytosol. Le récepteur se dissocie alors de la protéine de choc thermique (hsp 90) et il migre dans le noyau sous forme d'homodimère pour se lier au GRE (séquence spécifique d'ADN). Cela inhibe la transcription soit en se liant au domaine de régulation négatif de gène spécifique soit par interaction de deux protéines avec les facteurs de transcription de ces même gènes.
On peut observer différents effets sur les cellules dont la prolifération, le métabolisme ou la différenciation. Dans les cellules tumorales, les HG modifient la production de fibronectine quantifiable par incubation de cellules traitées à la dexaméthasone.
La fibronectine est attachée à la matrice extracellulaire des cellules qui les colle à la paroi de la boite de culture, c'est un phénomène d'adhérence cellulaire. C'est cette fibronectine qui sera diluée puis déposée sur un appareil de dot-blotting où une membrane retiendra cette protéine quantifiable par un système d'immunochimioluminescence.

Extraits

[...] Comparaison entre la série contrôle et la série dexaméthasone. Il est observable que, pour une même dilution, il y a une coloration qui est plus intense dans la série D. Cela permet de dire qu'il y a une augmentation du taux de fibronectine dans cette série. De combien est cette augmentation ? D'après la membrane, nous pouvons noter que le point de la dilution 1/64 de la série dex a la même intensité que le point de la dilution au 1/8 de la série contrôle. [...]

[...] Comparaison des situations avec ou sans D : - Dans les deux conditions, le marquage est hors du noyau : D n'a pas d'effet sur le transport de l'ARNm hors du noyau. - Avec le marquage est hors du noyau et sans il est dedans : D a un effet sur le transport de l'ARNm Régulation traductionnelle : Expérience : il faut tout d'abord rendre les cellules KO pour le gène de la fibronectine, puis incorporer dans les cellules de l'ARNm de fibronectine obtenu in vitro. L'introduction peut se faire à l'aide de vecteurs contenant l'ADNc correspondant à l'ARNm, après avoir rendu les cellules compétentes. [...]

[...] L'actinomycine bloque toute transcription donc elle arrête la transcription de la fibrolectine mais puisque cet effet entraîne une diminution de production de huit fois par rapport à la dexaméthasone qui elle la stimule, la régulation ne doit pas se faire au niveau de la transcription. En effet, on a la même augmentation de transcription si on passe de A à D+A et si on passe de C à D. Comparaison entre la série contrôle et la série actinomycine. Il y a la même coloration pour les mêmes dilutions alors que le traitement à l'actinomycine a été effectué 24h auparavant. Néanmoins, la demi-vie de la fibronectine est de 3J. Ainsi, en 24h, 1/6 de la transcription a été inhibée. [...]

[...] Cette solution est utilisée pour faire une dilution au dans du milieu frais. Par ce même procédé, des dilutions au 1/16, 1/32 et enfin au 1/64 sont effectuées. Dépôt sur membrane de PVDF (polyvinylidène difluride) : Un appareil de dot-blotting est utilisé pour réaliser les dépôts de culture sur la membrane. Il faut tout d'abord monter l'appareil, constitué, du bas vers le haut, d'un support pour le filtre, d'une chambre d'aspiration, de trois filtres de papier Watman imbibés de PBS, de la membrane préalablement trempée dans de l'éthanol puis du PBS, et enfin des puits où l'on dépose les solutions. [...]

[...] La phosphatase alcaline permet, après incubation, de révéler la fibronectine, grâce à deux substrats. Ces substrats, NBT et BCIP, sont ajoutés à un tampon de détection (tampon permettant de se mettre au pH de la phosphatase alcaline, autour de 9). En effet, la phosphatase alcaline catalyse l'oxydoréduction de ces substrats, qui donnent un produit de coloration violette. Ainsi, une coloration violette indique la présence de l'anticorps secondaire, donc de l'anticorps primaire, et donc de la protéine d'intérêt. Une amplification du signal est créée par le fait que plusieurs anticorps secondaires se fixent sur un anticorps primaire. [...]