La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne)

Résumé du document

La PCR est une méthode qui permet d'obtenir rapidement une quantité importante et exploitable d'un segment précis d'ADN, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant. Elle consiste en une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces qui définissent, en la bornant, la séquence à amplifier. De plus, ces amorces sont capables de s'apparier spécifiquement avec chacun des deux brins d'ADN complémentaires aux extrémités de la portion d'ADN à amplifier. L'atout de cette méthode est l'utilisation des produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est ainsi exponentielle. Cependant, cela nécessite de connaître une partie de la séquence nucléotidique à copier

Extraits

[...] Le protocole d'extraction de l'ADN est présenté en Annexe 2 et concerne uniquement l'ADN génomique des bactéries. De plus, l'extraction s'effectue par une solution d'InstaGene Matrix provenant des laboratoires BIO-RAD, spécifique à l'extraction d'ADN, conservée à et devant être homogénéisée avant l'utilisation à l'aide d'un agitateur magnétique à vitesse modérée ou d'un vortex, afin de maintenir la matrice en suspension. Les extraits d'ADN ainsi obtenus sont conservés à -20°C. Suite à cette extraction d'ADN, un contrôle de la qualité de l'extrait peut être effectué par électrophorèse dans du Tampon TBE 0,5X, sur gel d'agarose à (migration 2 heures à 80 Volts) La PCR L'extraction d'ADN effectuée, la réalisation d'une PCR peut être réalisée. [...]

[...] Réaction de Polymérisation en Chaîne PCR I. Principe de la PCR II. Protocole de la technique de PCR 1. L'extraction d'ADN 2. La PCR 3. L'amplification 4. L'électrophorèse en gel d'agarose 5. Sécurité I. Principe PCR (Polymerase Chain Réaction) La PCR est une méthode qui permet d'obtenir rapidement une quantité importante et exploitable d'un segment précis d'ADN, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant. [...]

[...] L'extraction d'ADN - Salle Recherche Microbiologie Réalisation du mix - Salle Mix sous la hotte (Poste de Sécurité Microbiologique de type II) Distribution de l'ADN cible - Salle d'électrophorèse Cycle PCR - Salle du thermocycleur Réalisation du gel d'électrophorèse - Salle d'électrophorèse Lecture du gel - Salle Mix Particularités de la Salle Mix Il est obligatoire de changer de blouse lors de l'entrée dans la Salle Mix. Sous la hotte, le microbiologiste doit utiliser des gants sans talc. De plus, les pipettes placées sous cette hotte ne doivent pas en bouger. Les réactifs nécessaires, qui sont conservés d'ordinaire au congélateur ou au réfrigérateur, doivent être conservés dans de la glace pilée lors de la manipulation. [...]

[...] Cette enzyme a été isolée d'une archéobactérie : Thermus aquaticus. La polymérisation se fait par ajout successif de désoxyribonucléotides (Adénine, Cytosine, Guanine, Thymine). Chaque base ajoutée est complémentaire à la base correspondante du brin matrice. On peut remarquer que cette polymérisation ne s'arrête pas à la longueur souhaitée, la copie est plus longue que la portion à copier. Le cycle suivant prendra les n doubles hélices obtenues après l'élongation afin de les dénaturer et ainsi obtenir 2n doubles hélices à la fin du cycle. II. [...]

[...] Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est ainsi exponentielle. Cependant, cela nécessite de connaître une partie de la séquence nucléotidique à copier. La PCR s'effectue en plusieurs cycles, chacun étant constitué de trois phases présentées en Annexe 1 : Phase 1 : Dénaturation à 95°C A cette température, les liaisons faibles (liaisons hydrogènes) qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN. Phase 2 : Hybridation à 40-65°C L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. [...]