Observations au microscope et coloration de Gram

Résumé du document

Avant de commencer toute manipulation, il faut se laver les mains et désinfecter la paillasse avec de l'eau de javel, pour travailler dans un milieu stérile et pour éviter toute autre contamination par le « milieu extérieur ». Ce qui donnerait des résultats erronés et fausserait les conclusions qui seront faites par la suite.

On stérilise le milieu de travail, et on approche tout le matériel dont on a besoin, pour la manipulation, de la flamme pour se mettre dans des conditions de stérilité optimale. On prend une pipette Pasteur effilée que l'on passe dans la flamme pour la stériliser. Puis on prélève dans la boîte de Pétri, ouverte du côté de la flamme, après avoir laissé refroidir la pipette, toujours dans le milieu stérile proche de la flamme, des souches avec la pipette Pasteur effilée que l'on dépose sur la lame qui se trouve proche de la flamme. On stérilise de nouveau la pipette avant de la mettre dans la poubelle à déchets contenant des produits de désinfection comme de l'eau de javel. On prend une nouvelle pipette Pasteur que l'on passe dans la flamme, et on prélève de l'eau pure dans un tube après y avoir passé son extrémité dans la flamme. On verse quelques gouttes d'eau pure sur la lame, puis on homogénéise la solution (eau+souche) avec la pipette, sur une surface assez importante pour pouvoir séparer les colonies et mieux les observer au microscope. Avant de refermer le tube contenant de l'eau pure, on place l'extrémité du tube dans la flamme pour éviter toute contamination par les micro-organismes qui se trouvent dans l'air ambiant. Puis on met à nouveau le bout de la pipette Pasteur dans la flamme avant de la mettre dans la poubelle. On place la lamelle sur la lame pour regarder au microscope l'était frais de la souche étudiée.

On réalise ce protocole pour les deux souches étudiées, la souche Psa pure et la souche de l'environnement T.

Extraits

[...] On dispose d'un tube contenant de l'eau pure et un deuxième avec de l'eau peptonée. On utilise une pipette Pasteur dont on met son extrémité dans la flamme pour la stériliser. On met les extrémités des deux tubes dans la flamme puis on prélève avec la pipette Pasteur stérilisée quelques gouttes d'eau pure que l'on met dans le tube contenant l'eau peptonée. Avant de refermer les tubes, on met leur extrémité dans la flamme pour les tuer les micro- organismes qui auraient pu s'y mettre. [...]

[...] On travaille toujours en milieu stérile et on passe à nouveau de l'eau de javel sur la table de travail avant les étalements. On passe l'extrémité d'une nouvelle pipette Pasteur dans la flamme du brûleur, puis on fait de même avec le tube contenant le bouillon. On prélève quelques gouttes du bouillon, que l'on dépose sur la lame qui a été passée dans la flamme pour la stériliser. La lame est posée sur le côté du brûleur pour garder la stérilité au maximum. [...]

[...] Les conclusions peuvent donc être partiellement fausses. II - Etude des souches pures La souche pure que nous avons étudiée est appelé Psa et selon la description faite à partir du microscope nous pourrons déterminer le type de colonies appartenant à cette souche Etude macroscopique des colonies A l'aide du microscope, nous avons déterminé les caractéristiques suivantes : D'après les informations apportées par ce tableau, nous pouvons dire qu'il s'agit d'une colonie de type R Etat frais Nous avons réalisé un état frais à l'aide d'un bouillon nous permettant de faire une étude microscopique sans huile et avec une faible luminosité. [...]

[...] L'étape avec l'alcool sert à décolorer le cytoplasme des bactéries Gram négatives. En effet, elles ont une paroi pauvre en peptidoglycane, donc plus fine, ce qui va laisser passer l'alcool, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool, car elle est composée d'une "couche" de peptidoglycane plus importante donc plus épaisse. Elles resteront alors violettes. La dernière étape consiste à mettre quelques gouttes de safranine sur la lame que l'on laisse agir pendant une minute. [...]

[...] L'étude microscopique est faite en immersion totale de l'objectif en pleine lumière et cette fois avec le diaphragme ouvert. La coloration de Gram permet de distinguer deux groupes de bactéries : les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. Nous observons plusieurs morphologies pour cette souche : une forme courte appelée coccus et une forme allongée appelée bâtonnets courts arrondis en chaine Nous observons que les microorganismes de cette souche sont de couleur violette. Nous pouvons ainsi dire que ce sont des bactéries à Gram positif. [...]