Méthodes d’étude du système immunitaire

Résumé du document

La production d'anticorps
Nature de l'antigène:
[molécules plus ou moins purifiées (protéines, peptides, polyoses...), cellules entières ou
extraits cellulaires, antigène synthétique, haptène couplé à un porteur.…]
Choix de l'animal:
En fonction du type d'antigène : si l'on a un antigène de souris, on immunise une autre
espèce comme un lapin.
En fonction du type d'anticorps désiré : si on veut des anti-isotypes ou allotypes, l'immunisation se fera respectivement dans une autre espèce ou dans une espèceidentique.
En fonction du type d'expérimentation à réaliser : par exemple pour la production d'anticorps monoclonaux, la formation d'hybrides est plus efficace avec le rat ou les souris BALB/c.
Les autres paramètres sont la quantité d'immunsérum désiré, la facilité et le coût d'entretien de l'animal. Dans tous les cas, les animaux doivent être jeunes, adultes et en bonne santé.
Comme la réponse immunitaire est influencée par des caractères génétiques, on immunise plusieurs animaux en même temps pour diminuer le bruit de fond.

Extraits

[...] rosettes lyse dépendante du complément, billes magnétiques (MACS) cytométrie de flux (FACS) Une sous-population de cellules peut être sélectivement éliminée par un traitement avec un anticorps spécifique en présence de complément. 3b. MACS Les billes magnétiques peuvent être utilisée pour isoler des populations cellulaires à partir d'un mélange. Les cellules sont mélangées avec des billes magnétiques couplées avec un anticorps donné (par ex. anti-CD3). Elles peuvent alors être rapidement isolées ou éliminées en plaçant le tube dans un champ magnétique. 4b. Microscopie de fluorescence L'immunofluorescence est une méthode générale permettant d'identifier les antigènes dans les sections de tissus ou sur les cellules, ou d'identifier les anticorps dirigés contre ces antigènes. [...]

[...] blocage des sites non-spécifiques 4. lavages 5. dépôt du anticorps 6. lavages 7. dépôt du conjugué (Ab-enzyme) 8. lavages 9. dépôt du substrat chromogène 10. développement de la coloration 11. mesure de la densité optique dans les puits Il existe de nombreux variants de cette méthode de base, par des méthodes compétitives ou non-compétitives. http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/main.html 4a. Les épreuves immunoenzymatiques Western-blot Western blot (ou immuno-empreintes) 1. séparation des protéines dans un champ électrique et dans un gel dénaturant 2. [...]

[...] Cytométrie de flux Le tri cellulaire 4b. Cellules : tests qualitatifs et quantitatifs Cytométrie de flux Détection des cytokines intra-cellulaires : stimulation blocage de la sécrétion des protéines (Brefeldin marquage de surface (anti-CD3, anti-CD4 ) fixation perméabilisation (saponine) marquage intra-cellulaire (anti-cytokines) Cytometric Bead Array billes recouvertes d'un anticorps dirigé contre une protéine à doser dans un mélange dépôt du mélange dépôt d'un anticorps conjugué (fluorescent) passage des billes dans le cytomètre analyses multiples possibles 4b.La mesure de la lymphoprolifération MLC (Culture mixte lymphocytaire) : unidirectionnelle par inactivation d'un type cellulaire pour empêcher sa prolifération et mesure de la prolifération de l'autre type cellulaire par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée. [...]

[...] Le "tetramer staining" 4b. Le "tetramer staining" 4b.ELISPOT 5b. Cellules formant plages Cellules formant plages : mise en évidence des cellules productrices d'anticorps sur un tapis de globules rouges. Indirectes : Mise en évidence des IgG par ajout d'un anti-IgG puis du complément. Directes : pour la détection des IgM qui peuvent provoquer une lyse complément dépendante juste par ajout de ce dernier. On peut ainsi estimer séparément les deux catégories de cellules productrices face à un antigène donné. Les anticorps monoclonaux Les anticorps monoclonaux sont des anticorps homogènes produits par un seul clone de cellules. [...]

[...] L'utilisation d'un tampon à pH élevé ou faible, contenant des agents dénaturants, permet de dissocier les liaisons antigène-anticorps et d'éluer les anticorps spécifiques. Le couplage d'un anticorps sur la phase solide permet de purifier un antigène. Le marquage des anticorps Fluorochromes FITC TRITC Texas red Phycoérythrine http://pingu.salk.edu/flow/fluo.html Radio-éléments Enzymes Systèmes d'amplification Système avidine-biotine Système enzyme / anti-enzymes 4a. Précipitation immunologique. On utilise une particularité de l'interaction Ag-Ab, à savoir la formation par ces deux partenaires d'un réseau de précipitation. Lorsqu'on ajoute différentes quantités d'antigène à une quantité fixe d'anticorps (ou l'inverse), un complexe se forme suite à la liaison des deux réactifs. [...]