Immunothérapie anti-tumorale par vecteur bactérien vivant, recherche d’un milieu chimiquement défini

Résumé du document

Les bactéries du genre Legionella sont responsables de la légionellose, appelée aussi « maladie du Légionnaire », une maladie connue depuis l'épidémie de 1976 à Philadephie survenue chez des combattants de la Légion américaine (Fraser, 2005). Dans sa forme la plus aiguë, la légionellose conduit à une pneumonie grave qui, en l'absence d'un traitement antibiotique rapide (fluoroquinolones, macrolides), peut conduire au décès de 10 à 20% des patients, et plus particulièrement des patients âgés, immuno-déprimés, diabétiques ou tabagiques ou atteints d'affections respiratoires chroniques. En France, 1527 cas de légionellose sont survenus en 2005, dont 152 ayant entraînés le décès des patients. La forme bénigne de la légionellose est la fièvre de Pontiac, dont les symptômes s'apparentent à ceux de la grippe (Fields et al., 2000).
Les bactéries Legionella présentent un formidable potentiel adaptatif puisqu'elles sont présentent dans des environnements naturels présentant des caractéristiques physico-chimiques diverses, tels que les sols humides, l'eau des lacs et des rivières, mais également dans des habitats « artificiels » créent par l'homme tels que les canalisations de distribution d'eau potable, les douches, les spas, les climatisations... Ces bactéries sont présentes sous forme libre, mais sont aussi capables de se multiplier dans une très grande variété de protozoaires comme des amibes (Acanthamoeba, Dictyostelium, Hartmanella, Naegleria) et des ciliés (Tetrahymena) (Fields et al., 2002). La technologie humaine a créé des conditions favorables en faveur de l'exposition et la contamination éventuelle à l'homme. En effet, la transmission se fait par inhalation de micro-gouttelettes d'eau ou d'aérosols contaminés, et générés par exemple par les tours aéro-réfrigérantes, les climatisations, les humidificateurs d'air, les bains bouillonnants, les fontaines, les systèmes d'arrosage, etc. Dans ce cas, les bactéries infectent les macrophages présents dans les alvéoles pulmonaires, entraînant leur lyse puis celle des pneumocytes, créant ainsi une nécrose des tissus environnants et une inflammation. Le processus d'infection des macrophages est analogue à celui utilisé pour l'invasion des amibes. Il s'agit donc d'un cas incontestable d'introduction d'une bactérie pathogène dans la population humaine et d'émergence d'une nouvelle pathologie liée à la technologie humaine. Les traitements par des méthodes de nature thermique (70°C) ou chimique (chloration) sont efficaces à court terme, mais le succès de ces traitements n'empêche pas une recolonisation à moyen terme, résultant de la vie intracellulaire de Legionella dans les amibes ou sous forme de biofilms.
Ainsi, dans l'environnement, les bactéries Legionella présentent une forte diversité écologique et un spectre d'hôtes très large, mais toutes les espèces ne semblent pas pour autant pathogènes pour l'homme. En effet, parmi les 48 espèces de Legionella décrites à ce jour, l'espèce L. pneumophila est responsable de plus de 90 % des cas de légionellose en France, 96 % étant liés au sérogroupe 1 parmi les 15 que contient cette espèce (Doléans et al., 2004). Cette répartition clinique diffère fortement de la situation observée dans l'environnement, où L. pneumophila sérogroupe 1 ne représente que 28% des isolats. Les isolats majoritairement détectés dans l'environnement, et donc les plus fréquemment au contact de l'homme, correspondent aux autres sérogroupes de L. pneumophila (47 % des isolats), qui ne représentent que 3 % des cas cliniques. Cela pourrait refléter l'existence de facteurs de virulence spécifiques ou d'un avantage sélectif particulier. Ainsi, un des enjeux des recherches menées sur cette bactérie est de comprendre pourquoi certaines espèces sont plus virulentes et réussissent à se disséminer de façon dramatique dans la population. Ainsi, le sujet de stage qu'il m'a été confié s'intègre dans une thématique globale qui visent d'une part à caractériser la diversité des isolats environnementaux et cliniques de L. pneumophila, afin d'identifier des marqueurs potentiels de virulence, et d'autre part à identifier les mécanismes moléculaires et écologiques de l'émergence de la virulence.

Extraits

[...] Elle se déroule dans un four à hybridation durant 4 heures à une température optimale pour l'hybridation (nous avons choisi d'hybrider à 68°C pour augmenter la spécificité). La membrane est incubée dans un tampon de préhybridation (agent bloquant (RocheTM) N-Lauroyl Sarcosyl SDS SSC(a) 2x). Après la pré-hybridation, la sonde préalablement dénaturée pendant 10 minutes à est ajoutée dans le même tampon d'hybridation. L'incubation est poursuivie pendant une nuit à 68°C sous agitation. Après l'hybridation, il reste l'étape de révélation qui consiste en une succession de lavages de la membrane. [...]

[...] De nombreux transposons bactériens effectuent une transposition réplicative aboutissant à la genèse de 2 ou plusieurs copies de l'élément transposable. Le premier objectif de ce stage a donc été d'évaluer le niveau de diversité et le nombre de copies de familles d'IS présentes dans des isolats naturels cliniques et environnementaux de L. pneumophila 1. Cette diversité a été mesurée par la technique de Southern blot (Warren et al., 2000) sur un échantillon de 43 isolats de L. pneumophila Mécanismes moléculaires de la virulence chez L. [...]

[...] Schechter LM, Jain Akbar Lee CA. The small nucleoid-binding proteins H-NS, HU, and Fis affect hilA expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. (2003) Sep;71(9):5432-5. Stout J.E. And Yu V.L. Legionellosis. N Engl J Med (1997) 337 682- 7 Warren RM, Sampson SL, Richardson Van Der Spuy GD, Lombard CJ, Victor TC, van Helden PD. Mapping of IS6110 flanking regions in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis demonstrates genome plasticity. Mol Microbiol. (2000) Sep;37(6):1405-16. [...]

[...] Philippe Alcaraz JP, Coursange Geiselmann Schneider D. Improvement of pCVD442, a suicide plasmid for gene allele exchange in bacteria. Plasmid. (2004) May;51(3):246-55. Rice PA. Making DNA do a U-turn: IHF and related proteins. Curr Opin Struct Biol. (1997) Feb;7(1):86-93. Review. Ryan VT, Grimwade JE, Nievera CJ, Leonard AC. IHF and HU stimulate assembly of pre-replication complexes at Escherichia coli oriC by two different mechanisms. [...]

[...] La région en amont d'ihfA a été amplifiée par PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides 106/109. La région en aval d'ihfA a été amplifiée par PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides 110/27. B. Obtention du fragment de 1400 pb délété pour ihfA. Les fragments en aval et en amont d'ihfA ont été amplifiés par PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides 106/27. ? et ? correspondent aux 3 possibilités pour le réappariement aléatoire des brins complémentaires suite à l'étape de dénaturation. [...]