Extraction ARN bactérien, dosage et analyse

Résumé du document

Les bactéries sont des organismes unicellulaires comportant tous les organites essentiels à leur survie. Elles disposent d'un seul chromosome circulaire et de plusieurs plasmides. Leur cytoplasme est particulièrement riche en ARN (ARNm, ARNt et surtout ARNr). On trouve un grand nombre de ribosomes qui sont constitués de protéines, d'ARNr 16s, ARNr 23s et d'ARNr 5s. Ces ribosomes sont divisés en deux sous-unités :
- Sous-unité 30s
- Sous-unité 50s
Le but de ce TP est d'extraire l'ARN bactérien à partir d'un culot de bactéries afin d'obtenir un extrait d'ARN, le plus pur possible. Ensuite, à partir de cet extrait que l'on fait migrer sur un gel d'agarose nous allons pouvoir identifier les différents types d'ARNs.

Extraits

[...] L'acétate de sodium va chargé positivement les histones et l'ADN va ainsi être entraîné lors de la centrifugation. Après centrifugation : La phase supérieure contenant l'ARN est prélevée et mise dans un nouveau tube, puis est ajouté de l'isopropanol qui va faire précipiter les ARNs. Le surnageant est enlevé puis le culot est lavé avec de l'éthanol 75% puis laissé sécher. On obtient un culot d'ARN bactérien, dans l'eau pure. Dosage de l'ARN bactérien extrait Le dosage de l'extrait bactérien va nous permettre par la suite d'estimer le degré de pureté de notre préparation. [...]

[...] La migration est effectuée avec différentes quantité d'ARN (calcul expliqué dans la partie description des résultats) : Dépôts Quantité d'ARN (µg) Volume d'ARN (µL) Volume de tampon 3X (µL) Volume d'eau (µL) Description des résultats Les mesures d'absorbance de notre extrait ARN, aux deux longueurs d'ondes utilisées, sont reportées ci-dessous : Longueur d'onde en nm Absorbance Pour savoir si notre solution est contaminée, il est nécessaire de faire le rapport de nos deux absorbances. Si ce rapport est compris entre 1,8 et 2 la solution est considérée pure. A260 / A280 = [...]

[...] La photographie de la migration sur gel nous a permis d'identifier les différents ARN présents dans les bactéries. Nous avons ainsi pu retrouver les poids moléculaires attendus pour les sous-unités ribosomiques 30S et 50S. De même, sur notre gel, nous avons pu observer la grande variabilité des ARNm en terme de poids moléculaire. En effet, l'observation de trainées nous montre que l'on trouve des ARNm de toutes tailles. L'ARNt a migré très rapidement dans le gel, étant donné que les mailles étaient de très grande taille par rapport au faible poids moléculaire de cet ARN. [...]

[...] TP : Extraction ARN bactérien, dosage et analyse Introduction : Les bactéries sont des organismes unicellulaires comportant tous les organites essentiels à leur survie. Elles disposent d'un seul chromosome circulaire et de plusieurs plasmides. Leur cytoplasme est particulièrement riche en ARN (ARNm, ARNt et surtout ARNr). On trouve un grand nombre de ribosomes qui sont constitués de protéines, d'ARNr 16s, ARNr 23s et d'ARNr 5s. Ces ribosomes sont divisés en deux sous-unités : Sous-unité 30s Sous-unité 50s Le but de ce TP est d'extraire l'ARN bactérien à partir d'un culot de bactéries afin d'obtenir un extrait d'ARN, le plus pur possible. [...]

[...] Ensuite la migration est révélée sous UV et la photographie suivante est obtenue : MM 5µg 10µg 15µg 20µg On observe deux bandes ainsi que des trainées dans chacune des pistes. Les deux bandes sont plus ou moins visibles selon les puits. En effet, quelle que soit la quantité d'ARN bactérien utilisé dans le dépôt au départ, nous observons les mêmes résultats, la seule différence étant que la piste contenant le moins d'ARN (5µg) est plus lisible que les trois autres. [...]