Diagnostic direct et indirect de la muciviscidose

Résumé du document

La mucoviscidose (ou fibrose kystique du pancréas) est une maladie génétique grave, la plus fréquente dans les populations blanches d'origine européenne (un nouveau-né sur 2 500 en France). La transmission est autosomique récessive. Les principaux organes touchés sont l'appareil respiratoire, le tube digestif et ses annexes (pancréas ++) mais aussi les glandes sudoripares et le tractus génital.
Cette maladie génétique est due à une mutation du gène CFTR, localisé sur le bras long du chromosome 7. C'est un grand gène de 250 kb, organisé en 27 exons ; il code une protéine de 1480 acides aminés dont la fonction principale est d'être un canal chlore. Une mutation majeure, la ΔF508, est retrouvée dans 70% des cas de mucoviscidose chez les européens, mais plus de 950 autres mutations ont été identifiées. Cette mutation est une délétion de trois nucléotides, dans l'exon 10 du gène CFTR.

Extraits

[...] Le diagnostic peut être direct ou indirect. Le diagnostic direct Le principe est de détecter directement la mutation par électrophorèse. L'électrophorèse sur gel d'acrylamide est une technique de forte résolution, au nucléotide près. Lors d'une électrophorèse, la distance de migration est inversement proportionnelle à la taille du fragment. Ainsi, l'allèle muté, correspondant à une délétion de trois bases, est plus petit que l'allèle sauvage, donc migre plus loin. L'électrophorèse permet donc de voir cette différence de taille de l'allèle et ainsi de détecter la mutation. [...]

[...] La PCR se fait à l'aide de deux amorces. Pour amplifier directement l'exon 10, où se situe la délétion, les amorces utilisées sont les amorces DFF et DFR. Le diagnostic indirect Il se fait à l'aide de marqueurs RFLP (polymorphisme de longueur de fragments de restriction). En effet, le génome contient des loci anonymes, qui peuvent correspondre à des sites de restriction pour des enzymes. Ces loci peuvent être mutés, ce qui fait que les enzymes de restriction ne peuvent plus les couper. [...]

[...] La délétion de 3 pb est bien visible. Les valeurs 100 et 102 correspondent aux tailles des hétéroduplex. Pour le marqueur MetH (photo Le locus MetH se trouve sous deux formes : tout d'abord la forme sauvage, notée qui comporte un site de restriction pour l'enzyme Msp1. En cas de digestion par cette enzyme de restriction, on obtient deux fragments de taille différente, donc deux bandes sur le gel. On a aussi la forme mutée, notée qui ne comporte plus de site de restriction. [...]

[...] Ainsi, ces deux individus ne possèdent que l'allèle muté, ils sont qualifiés d'homozygotes récessifs. Taille des fragments (voir courbe 2 en annexe): D'après les distances de migration mesurées pour les trois membres de la famille, on a pu déterminer les résultats suivants : Remarque : 1230 pb correspond au fragment entier et 398 pb correspondent aux tailles du fragment coupé en deux par l'enzyme de restriction Taq1. Or 609 + 398 1230 Il peut y avoir différentes hypothèses expliquant cela : - Le gel d'agarose a une moins bonne résolution que le gel d'acrylamide, du coup les mesures ne sont pas aussi précises. [...]

[...] Cela correspond à des individus hétérozygotes. La mutation du gène étant une délétion de trois nucléotides, l'allèle muté est de plus petite taille que l'allèle normal. Or, lors d'une électrophorèse, les plus petits fragments migrent plus loin que les plus gros. Par conséquent, l'allèle muté correspond à la bande qui est le plus bas, donc qui a le plus migré (voir photo A). Remarque : on visualise aussi, à une taille plus importante (plus haut), deux autres bandes, d'intensité plus faible, pour ces individus. [...]