Les cytosquelettes des cellules cancéreuses HT29

Résumé du document

Le cytosquelette des cellules eucaryotes est constitué par un réseau de filaments protéiques. La lignée étudiée est celle des cellules cancéreuses HT29 du tissu épithélial du colon humain.
Le but de cette expérimentation est de localiser les protéines du cytosquelette dans les cellules cancéreuses. Leur position à l'intérieur des cellules et l'agencement entre les différentes protéines seront étudiées.
La lignée HT29 a été choisie car ce sont des cellules cancéreuses qui gardent toutefois des caractéristiques de cellules saines. Elles diffèrent du tissu sain par trois propriétés non négligeables : la perte du principe d'inhibition de contact, la perte de la polarité cellulaire (problème de mitose, déplacement des organites) et celle de la bordure en brosse (problème fonctionnel). Ces anomalies montrent la présence d'un cytosquelette plus complexe dans les cellules saines. Les protéines du cytosquelette étudiées ici sont la β - tubuline, la β - actine, l'α - actinine et les cytokératines.
La technique utilisée est une immunodétection indirecte, à l'aide d'anticorps monoclonaux. L'immunofluorescence permettra de révéler l'agencement des protéines du cytosquelette de la lignée HT29.

Extraits

[...] Ces structures sont caractéristiques à certains groupes cellulaires. En comparant les caractéristiques théoriques aux caractéristiques trouvées lors de l'expérimentation, les cellules peuvent être identifiées. L'anormalité des cellules peut également être décelée grâce à cette technique et permettre par la suite d'établir un diagnostic. Le Western Blot permet également la reconnaissance spécifique de protéines. L'étude porte sur la migration des protéines selon leur taille et leur poids moléculaire. La distance de migration sera spécifique à une protéine. Ainsi, une migration qui se distingue de celle attendue traduira une anomalie dans la synthèse de la protéine. [...]

[...] Les parois des compartiments sont enlevées de la lame support. Une goutte de solution de montage est ajoutée pour conserver la fluorescéine. La préparation est ensuite recouverte d'une lame mince. L'observation s'effectue au microscope confocal à épifluorescence (grossissement x 400). Une radiation excite le fluorochrome qui perd de l'énergie : il y a émission d'un rayonnement vert. En parallèle de ces préparations, une manipulation similaire est faite pour un témoin négatif. Il permet de montrer les fixations spécifiques observables. L'anticorps primaire est du sérum de souris, non dirigé contre un anticorps anti-protéine du cytosquelette. [...]

[...] L'actine est un des constituants majeurs du cytosquelette, il est un composé essentiel des microfilaments. L'actine a une fonction dans le maintien structural de la cellule épithéliale notamment dans celui des microvillosités. Dans la cellule saine colique, cette protéine est retrouvée sous forme de fins filaments parallèles entre eux. Des faisceaux réguliers sont donc formés grâce à cette organisation. Ces derniers sont reliés transversalement par d'autres protéines, telles que l'actinine, et se présentent sous forme de câbles rigides. Dans la cellule cancéreuse HT29, ces filaments, les plus fins du cytosquelette, ne sont pas visibles à l'épifluorescence. [...]

[...] Le cytoplasme est abondamment fluorescent. Il est donc particulièrement dense en cytokératine formant un réseau de filaments cytoplasmiques. Les jonctions cellulaires sont très marquées. FIGURE 5 : Cellule HT29 en culture en présence de sérum normal de souris : Cellule témoin. Les cellules épithéliales de côlon HT29 marquées avec l'anticorps primaire de sérum de souris ont été révélées par une technique d'immunofluorescence indirecte. OBSERVATION 5 : La cellule est fluorescente sur toute la surface. Le marquage est donc non spécifique et homogène. [...]

[...] Les compartiments contenant les cellules sont lavés deux fois par une solution de PBS (Phospahate Buffered Saline). C'est une solution isotonique à pH neutre qui est composée de 138 mM NaCl mM KCl mM Na2HPO mM KH2PO4. Ce rinçage permet d'éliminer complètement le milieu de culture et d'enlever d'éventuelles cellules mortes et débris cellulaires non étudiables. Le méthanol est ajouté puis les compartiments sont incubés dix minutes à 4 Cet alcool perce les membranes, les rendant ainsi perméables aux marqueurs fluorescents. [...]