Bases moléculaires de l’activation constitutive de NF-kB dans les lymphomes T cutanés: implication des voies de signalisation MAPK et AKT?

Résumé du document

Les lymphomes T cutanés (LTC) à des stades avancés représentent un véritable enjeu thérapeutique car aucun traitement n'induit de rémission durable. Il a été montré que les cellules tumorales de LTC présentent une résistance à l'apoptose due à une activation constitutive de la voie NF-kB (Nuclear Factor kB), principalement de la voie classique (Sors et al, Blood 2006). Cependant, les mécanismes qui conduisent à l'activation constitutive de NF-kB dans les LTC ne sont pas clairement élucidés.
Ce travail s'intéresse à l'implication possible des voies MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) et Akt (de la famille des serine-threonine-specific protein kinase) dans la dérégulation de la voie NF-kB. Pour ce faire, nous avons traité des cellules de lignées de lymphomes T cutanés avec des inhibiteurs spécifiques de certains acteurs moléculaires de ces voies. Les résultats montrent un rôle particulièrement essentiel de la protéine Akt dans la prolifération et la survie des cellules de lymphomes T cutanés, ceci, en partie tout au moins, via l'activation du facteur de transcription NF-kB.

Extraits

[...] En effet, nous observons que le LY à 20µM sur les cellules Hut 78, Jurkat, provoque une diminution de l'expression de la protéine AKT ( figure 7). Figure 7 : western-blot des extraits protéiques des cellules HUT après traitement avec les inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation JNK, AKT et NF-kB pendant 16h (révélation de la protéine AKT) La forme phosphorylée d'AKT est toutefois révélée dans toutes les conditions, quelles que soient les cellules utilisées, cela indique une activation permanente de la voie Akt dans les lignées cellulaires cultivées en présence de sérum, c'est-à-dire recevant des facteurs de croissance (figure 8). [...]

[...] Les membranes sont lavées dans le tampon TBS tween 20 incubées avec l'anticorps secondaire et révélé comme précédemment. 5-Transfection cellulaire La transfection permet l'introduction d'un ADN exogène dans une cellule eucaryote. Le milieu des cellules de la lignée SeAx et des cellules de la lignée Jurkat est changé la veille de la transfection. Un plasmide exprimant le gène de la luciférase associé au plasmide IgK, qui contient des sites de fixations pour le facteur de transcription NF-kB placés en amont du gène codant pour la luciférase, ou encore des plasmides contenant un gène rapporteur AP1-Luc ou ConA-Luc (contrôle) sont transfectées par électroporation grâce à l'appareil Amaxa®. [...]

[...] L., Rosen S. T. (2006) selective protein kinase C béta inhibitor Enzastaurin induces apoptosis in cutaneous T-cell lymphoma cell lines through the AKT pathway”, J Invest Dermatol, 127: 1641-7. 13) Courtois G., Agou F., Michel L. (2006) Inhibition pharmacologique de la voie de signalisation NF-kB Hématologie, 12: 50-60 14) Bassières D. S. and Baldwin A. S. (2006) “Nuclear Factor-kB and inhibitor of kB kinase pathways in oncogenic initiation and progression”, Oncogene, 15: 6817-6830 15) Luo J-L., Kamata H. [...]

[...] 4-Western Blot Afin de déterminer l'expression protéique et l'état de phosphorylation de certaines molécules susceptibles d'être impliquées dans l'activation constitutive de la voie NF-kB, des analyses sont effectuées par immunoblotting. a-Extraction protéique Afin d'extraire les protéines cytoplasmiques, les cellules sont centrifugées à à 1500tours/minutes pendant 10 minutes et les culots sont lavés dans 1ml de PBS (Phosphate-Buffered Saline) froid. Après une centrigugation à 6000rpm à pendant 1 minute, les culots sont repris dans 60μl de tampon de lyse (Hepes 10mM pH7,8, Kcl 10mM, MgCl2 2mM, EGTA 0,1mM, DTT 1mM), vortexés énergiquement puis laissés pendant 10 minutes dans la glace. [...]

[...] La modulation de l'activité transcriptionnelle de NFkB dans les cellules tumorales par le LY294002 ou le dominant négatif d'Akt démontre que la voie Akt interagit avec l'activation de NFkB. Les résultats obtenus en western-blot confirment cette interaction. L'une de nos hypothèses est qu'Akt serait constitutivement activée suite à une activation chronique de la voie du TCR et activerait le complexe IKK soit directement, soit en interagissant avec le complexe BCL10-CARMA1-MALT1. Des expériences de cotransfections de dominants négatifs des différents partenaires de la voie du TCR sont nécessaires pour étayer cette hypothèse. [...]