Les bases fondamentales de la Biologie Moléculaire

Résumé du document

Chaque discipline possède son propre jargon, la biologie moléculaire n'échappe pas à cette règle. Il est essentiel de connaître la signification des mots comme sonde,hybridation, dénaturation, homologie, stringence pour pouvoir appliquer les méthodes de la biologie moléculaire et interpréter correctement les résultats obtenus à l'aide de ces méthodes. L'objectif de ce chapitre est de décrire, pour les non-spécialistes, les
principales techniques fondées sur les principes de la biologie moléculaire et de définir le vocabulaire de base utilisé dans cette discipline.

Extraits

[...] Ainsi une molécule d'ADN très longue (2000 kb) passera plus de temps à se réorienter qu'à se déplacer, tandis qu'une plus petite molécule (200 kb) passera plus de temps à migrer. Un nouveau domaine de recherches en biologie moléculaire a pris naissance grâce à l'électrophorèse en champ électrique pulsé. Cette technique permet de localiser très 9 rapidement un gène quelconque chez les organismes qui possèdent un génome de taille relativement petite (procaryotes et eucaryotes inférieurs) et de situer des fragments d'acide nucléique les uns par rapport aux autres. [...]

[...] Après autoradiographie, il est possible de directement la séquence en suivant la taille des chaînes d'ADN néosynthétisées, de la plus petite à la plus grande. Il existe aujourd'hui des méthodes de séquençage automatisées dans lesquelles le marquage par un radio-isotope est remplacé par un marquage fluorescent. Si les appareils de première génération actuellement commercialisés représentent indéniablement un progrès considérable dans l'automatisation du séquençage. A PPLICATIONS DES TECHNIQUES MOLECULAIRE EN BIOLOGIE MEDICALE DE LA BIOLOGIE La technique d'hybridation moléculaire est utilisée dans divers domaines de la biologie : génétique (humaine, animale ou végétale), microbiologie (bactériologie, virologie), typage tissulaire, cancérologie, médecine légale. [...]

[...] Les molécules d'ADN sont chargées négativement, placées dans un champ électrique elles migrent vers l'anode. Les molécules d'ADN plus petites que les mailles du réseau de fibres sont très peu freinées et migrent rapidement tandis que les molécules plus grandes sont ralenties. Le pouvoir résolutif de l'électrophorèse est excellent pour des fragments dont la taille est inférieure à paires de bases (50 kilobases ou kb). La résolution est environ de la taille du fragment. Au- delà de 50 kb, les fragments d'ADN ne sont plus séparés. [...]

[...] La technique d'amplification génique in vitro la plus utilisée aujourd'hui est celle qui est connue sous le sigle PCR (Polymerase Chain Reaction). Elle consiste en une multiplication exponentielle d'un fragment d'acide nucléique dont la taille est généralement comprise entre 200 et 3000 paires de bases. Cette technique utilise une ADN polymérase particulière, dénommée polymérase Taq, issue d'une bactérie (Thermophilus aquaticus ) vivant dans des sources d'eau chaude. Cette enzyme est stable à haute température et reste active pendant le déroulement de la PCR. [...]

[...] Pour éliminer les chaînes d'ADN courtes ayant des extrémitités 3'OH générées par les arrêts aléatoires de la polymérase on ajoute un excès des quatre dNTP. La réaction enzymatique est enfin arrêtée par l'addition de formamide. Après la troisième étape de la réaction de séquençage, chacun des quatre tubes contient un mélange de chaînes d'ADN marquées par un traceur radioactif. Dans un tube donné, le nombre de chaînes différentes néosynthétisées est égal au nombre de fois que l'on rencontre, dans le fragment d'ADN à séquencer, le nucléotide analogue au ddNTP ajouté dans ce tube. [...]