Analyse de l'expression du photopigment des bâtonnets, la rhodopsine, au cours du développement embryonnaire chez le poulet

Résumé du document

Dans l'évolution, la plupart des espèces sont dotées d'un sens très spécialisé qu'est la vision. Ce sens joue un rôle important dans l'appréciation de l'environnement. L'organe permettant la vison est plus ou moins développé selon les espèces et prend la forme d'un globe oculaire plus communément appelé l'œil. L'œil possède une structure complexe, il est composé notamment de la rétine située à l'intérieur de l'œil, qui est très sensible à la lumière et qui assure la phototransduction, c'est-à-dire le mécanisme par lequel la lumière détectée est convertie en signal nerveux.

Comme le montre le schéma ci-dessus, la rétine est organisée en plusieurs couches de cellules majoritairement nerveuses reliées à des cellules réceptrices à la lumière. Ces cellules photoréceptrices sont classées selon leur forme et leur fonction : les cônes, qui fonctionnent durant le jour et qui sont responsable de la vision colorée, et les bâtonnets, qui eux ne discernent pas la couleur et fonctionnent durant la nuit (détectent seulement la lumière de faible intensité). Notons tout de même qu'il existe un troisième type de photorécepteur, les cellules ganglionnaires photosensibles, qui jouent un rôle complexe en rapport avec l'horloge biologique.

La phototransduction est assurée par les cellules photoréceptrices grâce à des récepteurs protéiques couplés à la protéine G qu'on appelle les opsines. Ceux-ci contiennent le chromophore 11-cis-rétinal qui peut capter les photons, ce qui provoque une «photo isomérisation», c'est-à-dire un changement structural entre isomères sous l'effet d'une photo excitation. Ceci a pour conséquence de changer la conformation des opsines ce qui induit une cascade de transduction de signal intracellulaire aboutissant à une hyperpolarisation des cellules photoréceptrices (voir schéma).
La rhodopsine, molécule photorécéptrice spécifique des bâtonnets, est composée en partie de l'opsine, qui correspond à la partie transmembranaire du récepteur. La rhodopsine peut être considérée comme une protéine-récepteur qui serait déjà associée à un agoniste, qui correspond à la rétinène (dérivé de la vitamine A). L'absorption de lumière modifie la structure de la rétinène, ce qui active l'opsine et modifie les longueurs d'ondes absorbées par la rhodopsine. Ainsi, elle détecte plus particulièrement la lumière bleu-verte et est responsable de la vision «monochromatique» durant la nuit. Elle joue donc un rôle dans la perception visuelle, mais en plus de cela elle est responsable de la formation des cellules photoréceptrices durant le développement.


Le but de ce TP est de déterminer plus précisément le rôle que joue la rhodopsine dans le développement embryonnaire. En effet, on peut se demander quels sont les mécanismes qui font qu'une cellule neurale indéterminée se différencie en bâtonnet photorécepteur. Afin d'effectuer ceci, son expression sera analysée par hybridation d'une sonde radioactive sur Northern blot de l'ARNm correspondant, à différents stades du développement embryonnaire du poulet. D'autre part, pour déterminer la spécificité tissulaire de la rhodopsine chez les sujets adultes, les ARNm des échantillons tissulaires adultes feront l'objet de la même expérience. Le deuxième objectif sera de localiser la protéine Rhodopsine par immunodétection sur des coupes histologiques de rétine adulte de poulet afin de visualiser au microscope photonique son expression spécifique dans certaines cellules.

Extraits

[...] L'association de ces deux tampons permet la formation de complexe avidine-biotine-peroxydase et ainsi l'amplification du signal. Ensuite les lames sont rincées 10 min dans du PBS. De la DAB (diaminobenzidine) et de l'H2O sont ajoutées au dernier moment à la solution de révélation, et le tout est déposé sur les lames. La DAB permet de colorer la peroxydase en marron ou violet en présence de Nickel. La réaction est réalisée à l'obscurité pendant 5 min révélant la localisation des protéines. [...]

[...] Déparaffinage et réhydratation Deux lames sont données par l'enseignant dont une seule est incubée avec l'anticorps primaire. L'autre lame constitue le témoin et n'est couplée qu'avec l'anticorps secondaire pour savoir si l'anticorps secondaire est spécifique de l'anticorps primaire. Les coupes histologiques étant fixées au liquide de Bouin et incluses dans la paraffine, doivent être déparaffinées par chauffage puis immergées dans un flacon Borel rempli de toluène qui dissout la paraffine. Chaque lame subit des bains successifs de solutions d'éthanol de concentration décroissante puis d'eau afin de réhydrater les coupes, les anticorps ne pouvant se complexer qu'en milieu aqueux. [...]

[...] Analyse de l'expression du photopigment des bâtonnets, la rhodopsine, au cours du développement embryonnaire chez le poulet Structure 3D de la Rhodopsine Introduction Dans l'évolution, la plupart des espèces sont dotées d'un sens très spécialisé qu'est la vision. Ce sens joue un rôle important dans l'appréciation de l'environnement. L'organe permettant la vison est plus ou moins développé selon les espèces et prend la forme d'un globe oculaire plus communément appelé l'œil. L'œil possède une structure complexe, il est composé notamment de la rétine située à l'intérieur de l'œil, qui est très sensible à la lumière et qui assure la phototransduction, c'est-à-dire le mécanisme par lequel la lumière détectée est convertie en signal nerveux. [...]

[...] Plusieurs rinçages par des solutions de rinçage Wash solution 1 et 2 permettent d'éliminer les contaminants. Après transfert de la colonne sur un tube propre, l'ARN est éludé dans de l'eau stérile, à l'aide d'une solution nommée Elution Solution Préparation des échantillons d'ARN pour l'électrophorèse Estimation de la concentration des solutions d'ARN Le but de cette estimation est de calculer le volume d'ARN à prélever pour avoir 15µg d'ARN dans les échantillons pour l'électrophorèse. Pour cela, la densité optique des échantillons est mesurée à 260 nm à l'aide d'un spectrophotomètre préalablement calibré. [...]

[...] Interprétation : Le transcrit de la rhodopsine est seulement présent à partir du stade E15 et dans la rétine. Conclusion : Il y a un contrôle dans le temps et dans l'espace de la transcription de la Rhodopsine. II - Immunodétection de la Rhodopsine Coloration au crésyl violet Figure 3 : Photographie d'une coupe de rétine de poulet colorée au Crésyl violet (Objectif 20) Cette photographie permet de visualiser les différentes couches de la rétine de poulet. Elle servira de repère pour visualiser quelles couches sont concernées par l'immunodétection de la Rhodopsine, et ainsi dans quelles couches se trouve cette protéine. [...]