Etudes des paramètres cinétiques de la trypsine

Résumé du document

Etudes des paramètres cinétiques de la trypsine en présence et en absence d'inhibiteur dans le cadre d'un TP d'enzymologie.

Extraits

[...] C'est donc le BApNA qui a été utilisé comme substrat de la trypsine dans cette expérience. L'un des produits de coupure de ce substrat par la trypsine (la p-nitroalinine) absorbe à410nm ce qui permet un suivi spectrophotométrique de la quantité de produit formé au cours du temps solutions de concentrations différentes en substrat sont préparées. Une solution intermédiaire de BApNA à 240µM est préparée pour faciliter les volumes à pipeter et pouvoir toujours ajouter le même volume de solution de substrat dans les échantillons, permettant de ne pas prendre en compte l'influence que pourrait avoir le BApNA sur la lecture d'absorbance à 410nm. [...]

[...] Les points à considérer sont ci-dessous. 1/V en µM Tableau valeurs des inverses des courbes (voir Graph.1) en fonction des concentrations en inhibiteur 1/V (A.min-1) y 24,39x + R2 =0,9939 1200µM y =65,067x + R2 = -40 -20 - ( µM ) 900µM y =45,29x + R2 =0,9955 400µM Figure Représentation de DIXON de l'inverse de la vitesse en fonction de différentes concentrations en benzamidine pour différentes concentrations en substrat. Aussi, la solution mère de trypsine utilisée lors de ce TP avait une concentration de 0,9mg.mL-1. [...]

[...] Une représentation de Lineweaver Burk permet de déterminer KM et Vm. Une droite d'équation y = 559842x + 932,96 est obtenue. D'après cette équation, 1/Vm vaut 932,96 A.sec-1 donc Vm= 365 pkatal et KM vaut 600µM 1/V (A.s-1) y = 559842x + 932,96 R = (µM-1) Figure 1 : représentation de Lineweaver Burk de l'activité cinétique de la trypsine sur le BApNA à différentes concentrations (SM à SM6) Ainsi, étant donné que le Vm et la quantité d'enzyme totale sont connus, il est possible de calculer la constante catalytique kcat. [...]

[...] De plus c'est une enzyme digestive avec une température optimale de or nous travaillons avec une température expérimentale atteignant au maximum 20°C. Tous ces paramètres peuvent expliquer les problèmes rencontrés. Étant donné que le Vm peut être considéré comme fixe avec et sans inhibiteur, et que par contre le K M est variable, la réaction enzymatique est régie par une inhibition compétitive. [...]

[...] L'activation du trypsinogène en trypsine se fait par le biais d'une entérokinase et par autoactivation de la trypsine elle-même. Au cours de ce TP, l'étude a porté sur une trypsine porcine et l'expérience a pour volonté de déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme en présence et en absence d'inhibiteur et de trouver le type de mécanisme d'inhibition. Ici, l'inhibiteur est la benzamidine et celle-ci sera utilisée à différentes concentrations afin de pouvoir établir les graphiques nécessaires à la détermination des paramètres cités ci-dessus. [...]