TP d'introduction théorique et expérimentale à l'épigénétique

Résumé du document

L'épigénétique étudie les changements dans l'expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou de la méïose, et qui ne résultent pas de modifications de la séquence de l'ADN. Ainsi, on observe des modifications dites épigénétiques au niveau de l'ADN (méthylation des ilôts CpG), de la chromatine (code histone) et de l'ARN (ARN interférence). Les premières descriptions d'ARN interférence datent de plus de dix ans déjà et, d'un principe général, consiste en la dégradation ou l'inactivation d'un ARNm induit par un complexe RISC. Ce dernier a la particularité d'être composé d'une petite partie d'ARN (Misipi RNA) qui permet la reconnaissance par hybridation de l'ARNm (ci-dessous, un schéma général du mécanisme).

Extraits

[...] L'ir présente également une coloration uniforme, montrant la présence d'ERK. Au stade adulte, l'ir montre une différence entre mâle et femelle : chez la femelle les veines L4, pcv et L5 sont absentes tandis que chez le mâle le phénotype est aggravé avec la formation d'un vide au niveau des veines absentes (pas de tissu inter-veines). Une image du témoin permet de comparer les différentes ailes. INTERPRETATION : Disques imaginaux d'ailes : La coloration marron révèle la présence d'ERK. Or, si le siRNA est exprimé en partie postérieur des disques alors il ne devrait pas y avoir de coloration. [...]

[...] Transfection des cellules packaging par méthode polymère : 10µg de 4 vecteurs sont préparés pour l'étude : - pBabe : exprime un gène de sélection à la puromycine. - pGFP : exprime la GFP. - pMLS shm Trp53: exprime la GFP et le shRNA dirigé contre l'ARNm Trp53. - pMLP shm Trp53 : idem que pMLS shm Trp53 + le gène de sélection à la puromycine. Nom du vecteur pBabe pMLP shm Trp53 pGFP pGFP dilué pMLS shm Trp53 Tableau [vecteur] initial (ng/µL) Volume du vecteur à déposer (µL) (soit 28 de déposé) 66,6 (soit 67 de déposé) 67 (pour avoir un effet de dilution) 50 Ensemble des vecteurs utilisés dans la transfection La concentration initiale d'ecotropic helper est de 300µg/µL. [...]

[...] C'est ce que nous allons faire dans cette étude. Notre objectif est d'éteindre l'expression de Trp53 (43,7kDa / rôle dans le cycle cellulaire, au niveau de la réplication/réparation de l'ADN / gardien de l'intégrité du génome) dans les cellules NIH3T3. Pour cela, nous construirons un insert T-DNA qui code pour un shRNA qui cible l'ARNm de Trp53. Cet insert sera couplé à une séquence d'encapsidation dans un plasmide MSCV. Ce plasmide sera intégré aux cellules packaging qui sont en mesure de produire des virions (possèdent les gènes essentiels gag,env,pol désarmés (ne pouvant se répliquer). [...]

[...] Egalement, nous pouvons étudier le phénotype de nos cellules. En effet, cibler p53 c'est permettre aux cellules de rentrer en sénescence réplicative lorsque la culture arrive à confluence. Si le shRNA est exprimé, alors les cellules survivent. A l'inverse, si le shRNA n'est pas exprimé, les cellules enclecnche la mort programmée. INACTIVATION PAR ARN INTERFERENCE DU GENE ROLLED QUI CODE LA MAP KINASE ERK CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER Dans cette étude, nous allons travailler sur un des grands modèles de la génétique : Drosophila melanogaster. [...]

[...] Ce qui permet de dire que les cellules n'expriment pas la GFP naturellement. Le vecteur pBabe est un témoin négatif. Les vecteurs pGFP et pMLP shm Trp53 ont un pourcentage similaire d'environ 75% de cellules qui expriment la GFP (tableau 6). Ce pourcentage montre une bonne infection par les virions. L'expression de la GFP dans les cellules avec pMLP shm Trp53 rend compte indirectement de l'expression du shRNA. Traitement des cellules infectées : Estimation du pourcentage d'infection des cellules pMLP shm Trp53+ puromycine ou/et pBabe + puromycine (voir tableau 7). [...]