Techniques générales d'étude du génome humain normal et pathologique

Thèmes abordés

Génome humain normal, génome humain pathologique, variations du génome, étude des SNP, mutations ponctuelles

Résumé du document

Maladie monogénique:
- Si mutation → maladie
- Plus de 6000 référencées
- Fréquence faible : 1/10^3 à 1/10^6 voire moins
- La protéine n'est pas toujours connue (10 a 20% connu)
Maladies multifactorielles:
- Profil de polymorphismes
- Facteurs environnementaux

Extraits

[...] TECHNIQUES GENERALES D'ETUDE DU GENOME HUMAIN NORMAL ET PATHOLOGIQUE propriété physico-chimique des acides nucléiques interaction génome environnement homme = génome dans un environnement. la définition d'un gène (utilisée par le comité de nomenclature du génome humain) : segment d'ADN qui contribuent a une fonction ou un phénomène phénotype régulé par facteur environnementaux. gène de prédisposition = susceptibilité quand mute → maladie gènes modificateurs : présente polymorphisme = petite variation différent de mutation car → pas de maladie. [...]

[...] lyse des érythrocytes par une sol hypotonique saccharose 320 même MgCl2, 5mM Tris = acide faible qui permet de tamponner : 10mM, Ph 7,5 → tampon Triton X → détergent Centrifugation et lavage → culot de leucocyte 2. Lyse des leucocytes (choc hypotonique) + protéinase K → libération des acides nucléiques + protéine + lipides + extraction de l'ADN par phénol/Chloroforme ADN dans la phase aqueuse si pH alcalin ARN dans la phase aqueuse si pH acide Lipides dans la phase organique Protéine a l'interphase 4. [...]

[...] Structure des nucléotides utilisée en biologie moléculaire Désoxy Nucléoside triphosphate dNTP → ADN Nucléoside triphosphates NTP → ARN Didésoxi Nucléoside triphosphates ddNTP → utilisé pour séquençage PRINCIPE DE LA PCR les amorces : oligonucléoside (ADN) de 18 A 25 nt délimitation de la séquence a amplifier ADN double brin servant d'ancrage pour la Taq polymérase dNTP : substrat de la Taq polymérase Taq polymérase : les première ADN polymérases étaient issues d'eau chaude. [...]

[...] Elution de l'ADN par une solution de force ionique faible 6. Précipitation de l'ADN 7. Solubilisation de l'ADN QUANTIFICATION SPECTROPHOTOMETRIE DES ACIDES NUCLEIQUES Molécule Delat max Epsilone (M-1.cm-1) Trp Tyr Phe His Cys adénine adénosine guanine cytosine mesure a 260 nm → acides nucléiques (ADN, ARN) mesure a 280 nm → protéine (acide aminé aromatique) pour l'ADNds 1abs = 50micromg/ml pour l'ADNss 1unité d'Absorbance = 40 ug/mL A260/A280 = 2 TEMPERATURE DE FUSION DES SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES Tm = température de fusion = Température à laquelle 50% d'une séquence d'ADN est dénaturé sous forme simple brin Tm augmente avec : Le % de paire de bases GC La concentration en sels (force ionique) Les agents dénaturants (foramides, urée ) diminuent la Tm ADN simple brin absorbe plus que le double brin Plus il y a CG plus il y a liaison hydrogène EFFET HYPERCHROME : Augmentation de l'absorbance a 260 nm 30% en moyenne) Du a une perte de l'empilement des bases (stacking) conduisant une meilleurs excitabilité des des cycles aromatiques des bases azotés HYBRIDATION DES ACIDES NUCLEIQUES capacité des acides nucléiques a s'hybrider brin ADN unit par liaison hydrogène, rompu par la chaleur → passe de double brin a simple brin. [...]

[...] Soit on laisse refroidir doucement → réhybridation → double hélice dans état initial. Ou réchauffer vite → simple brin. A laquelle on peut rajouter d'autre séquence complémentaire. [...]