Les principales techniques d'étude utilisées en biologie

Résumé du document

Méthodologie de préparation de matériel pour la microscopie optique ainsi que pour la microscopie électronique : barres de Leuckart et microtonie. Fonctionnement de ces appareils et techniques d'observation. Nombreuses photos et schémas multiples de barres de Leuckart, de microtomes, de coupes et de microscopes.

Extraits

[...] On peut ainsi étudier le mode d'attachement de la bicouche lipidique constitutive de la membrane. la microscopie électronique à très haut voltage : cette technique permet de travailler sur des coupes épaisses et donc de voir les organites cellulaires dans leur épaisseur. On se rend compte par exemple, que des mitochondries qui apparaissent le plus souvent comme de simples structures orales peuvent en fait être très ramifiées. La technique du microscope à balayage est appréciée car elle donne des résultats esthétiques et faciles à interpréter. [...]

[...] Un matériel mal fixé est inutilisable. Le prélèvement de matériel biologique doit donc se faire soit par biopsie soit directement après la mort de l'animal. Pour réaliser des coupes histochimiques, il faut que le fixateur utilisé respecte l'intégrité des constituants chimiques du tissu. Nous avons fixé le matériel dans de l'éthanol à 70% qui permet de garder intactes, les propriétés du matériel. Il faut réaliser une dilution car il faut que le volume du fixateur soit au moins 5 fois supérieur au volume du tissu à fixer. [...]

[...] On récupère les grilles et on les rince dans 3 bains d'eau. On procède à la deuxième coloration avec le citrate de plomb qui est sensible au CO2. Pour éviter que ce dernier ne précipite, on coule de la paraffine dans le fond d'une boîte de Pétrie puis on place des pastilles de soude pour fixer le CO2 et du citrate de plomb. On place ensuite la grille sur le colorant pendant 10 minutes avant de rincer 3 fois à l'eau distillée et bidistillée. [...]

[...] La deuxième étape est l'inclusion : lorsque le matériel est fixé, il faut l'inclure dans un matériel solide permettant de réaliser des coupes. Nous avons utilisé de la paraffine qui a l'avantage d'être liquide à partir de 58°C et solide à température ambiante. Cependant, la paraffine n'est miscible ni à l'eau, ni à l'alcool, il faudra donc dans un premier temps éliminer l'eau des tissus à inclure. On procède donc à une déshydratation en plongeant le matériel dans des bains successifs d'alcool : dans l'alcool à 95 pendant 4 heures dans l'alcool à 95 pendant 3 heures dans l'alcool à 95 pendant 3 heures On passe ensuite par une solution intermédiaire de buthanol, en réalisant à nouveau 3 bains successifs : dans le buthanol pendant 4 heures dans le buthanol pendant 3 heures dans le buthanol pendant 3 heures Ensuite, on plonge les pièces déshydratées dans des bains successifs de butylparaffine. [...]

[...] Le pouvoir séparateur du microscope électronique est de 1nm. Le grossissement le plus direct peut atteindre au moins les fois. A ce grossissement initial, on ajoute un grossissement au moment du tirage photographique ce qui permet, dans certains cas particuliers, d'atteindre des grossissements terminaux de 1 à 2 millions de fois. Les électrons ayant une longueur d'onde très courte, ont un pouvoir de pénétration très faible. Les coupes devront donc avoir une épaisseur inférieure à 100nm. En règle générale, on considère que les coupes sont bonnes lorsqu'elles font environ 70nm d'épaisseur. [...]