Organisation des gènes chez les eucaryotes

Résumé du document

Cours sur la structure des gènes eucaryotes ainsi que les méthodes d'études. Cours de Master 1 avec un certain nombre de rappels et précisions sur les techniques de biologie moléculaire.

Extraits

[...] Structure des gènes chez les eucaryotes Rappels : organisation ( Seuls les exons sont traduits en protéines ( ATG : initiation de la traduction ( Introns : très variables d'un gène à l'autre (longueur) et peuvent intervenir dans la régulation des gènes ( Les gènes sont exprimés de manière différentielle (pas dans tous les tissus) ( représenté à gauche et à droite Région flanquante ( Importance dans la régulation de l'expression du gène. ( Contient une petite séquence de environ 100 nu : le promoteur minimal ( TATA box et CAA ( Permettent la mise en place de la RNA-polymerase pour la transcription Zone de contrôle ( Contient un certain nombre de motifs reconnus par les facteurs de transcription ( Reconnaissent nucléotides ( Activent ou répriment ( Eléments variable d'un gène a l'autre qui permet la différenciation (important du temps et de l'espace) Transcription ( Synthèse d'un ARN pré messager fait par la ARN polymérase 2 ( Epissage : permet l'excision de tous les introns ( On obtient un ARN messager contenant une région polyadenylée et la séquence codante du gène. [...]

[...] ( Marquage d'un seul des brins d'ADN ( Récupération et ajout des extraits nucléaires ( Utilisation d'une enzyme manière ménagée-, la DNAse 1 qui va grignoter l'ADN (endonucléase ( Les morceaux d'ADN sont de taille variable mais l'ADN ne sera pas coupé à l'endroit de la protéine ( On aura plein de petits morceaux et un plus grand ( Migration sur gel d'acrylamide - Sans extrait, il y aura des bandes régulières - Avec extrait, on observe un trou (là où s'est fixé la protéine) ( Méthode de séquençage de et : - Batterie de produits chimiques qui vont couper spécifiquement après un nucléotide donné - On met en mélange ces produits avec l'extrait cellulaire et l'ADN et on fait le parallèle. [...]

[...] ( La structure va faire prendre à l'ADN une certaine conformation ( Reconnaît le gène en fonction de l'état de la chromatine ( Si on modifie un acide aminé, c'est possible que ça bloque la transcription Leucine zipper ( Protéines contenant des régions en α-hélice ( Riches en leucine vont former des hélices et vont intéragir ( Elles fonctionnent sous un mode de dimères HLH : hélice boucle hélice ( Deux parties en α-hélice séparé par un feuillet β ( Un domaine lié à l'ADN ( Une partie reconnaît le grand sillon de l'ADN Les méthodes ( On isole une région de régulation et on veut l'étudier ( Quels facteurs pourraient intervenir ? [...]

[...] ( Transfection dans une cellule en culture ( On cotransfere un autre vecteur avec un autre gène (β-galactosidase dans une autre construction) ( des cellules vont exprimer ces deux constructions ( des cas : les cellule expriment les 2 ( L'activité Lac Z devrait être la même car c'est le même promoteur, ce qui donne le taux basal ( Standardisation interne (on doit avoir dans toutes les boites) ( Autant de boites que de mutants ( Calcul de l'activité CAT Calcul de l'activité CAT : ( En présence d'acetyl-CoA qui permet d'acetyler le chloramphénicol (dont deux sites peuvent être phosphorylés) ( Traduit l'efficacité transcriptionnelle de nos mutants ( Un gène donné est exprimé de manière fine selon le type de cellules ou l'on travaille ( Si on remarque que l'activité transcriptionnelle baisse énormément entre deux constructions, on peut penser que la région délétée est un ehancer Récupération des facteurs de transcription : ( Il faut donc le récupérer et le mettre en présence de la séquence d'ADN qui nous intéresse Récupération du facteur ( Culture de cellule HeLa ( Lyse ( Centrifugation ( Récupération des noyaux ( Travail à pour éviter l'action des protéases et avec des anti- protéases qui sont hautement cancérigènes ( Choc osmotique : pour retirer les histones ( Dyalise du tampon (mélange de facteur) contre une solution plus concentrée en sel pour concentrer les facteurs ( Extraits nucléaires : mélanges de protéines donc de facteurs de transcriptions Retard sur gel : ( On met le fragment d'ADN isolé et marqué avec des nucléotides radioactifs ( Mise en présence d'extrait nucléaire ( Migration sur gel ( Observation d'une bande retardée (l'ADN a fixé une ou plusieurs protéine donc facteur de transcription) ( On peut refaire la même expérience avec un anticorps anti-AP1 (si on pense que le facteur de transcription est AP1) - Si c'est ça on a une bande encore plus retardé - Si ce n'est pas ça on voit rien ( Transférer l'extrait sur une membrane de nylon et ajouter l'anticorps ( On peut mettre de l'ADN froid contenant la séquence consensus d'AP1 qui disparaîtra de manière importante. DNA Foodprinting : ( Région de régulation sur laquelle on sait qu'il y a une protéine X ( Quelle séquence nucléotidique va fixer le facteur ? [...]

[...] ( Des virus n'ont qu'une TATA box donc utilisent les facteurs de T de la cellule infectée ( Certains organismes n'ont pas de TATA box Séquence consensus ( Plusieurs nucléotides reconnus par un facteur donné ( Il existe des variations ( On établi des séquences consensus si on trouve les mêmes nucléotides au même endroit avec de petites variations ( Il est probable que des facteurs qui se fixent en se fixent à des facteurs plus proximaux (facteur de transcription que l'on retrouve tout le temps) pour interagir grâce à la courbure de l'ADN ( Des facteurs plus distaux vont réguler la ARN polymérase ( Ehancer (augmenter) / silencer (reconnues par des facteurs qui vont inhiber la transcription de manière importante) ( La transcription d'un gène peut être très différente sur le même gène mais dans une autre cellule Les facteurs de transcription Facteurs généraux de transcription ( La mise en place d'un facteur peux faciliter la mise en place d'un autre ( Facteurs de base nécessaires à la mise ne place de la ARN polymérase ( Nommés TF quelquechose Facteurs transactivateurs ( Spécifique des promoteurs ( Plutôt dans les régions proximales du coté du promoteur Facteurs transactivateurs des ehancers Facteurs transactivateurs spécifiques ( On ne les trouve que dans certains tissus (ex : MyoD1) ( Se combinent avec d'autres facteurs (cellules musculaires lisses ou squelettiques) ( NFB1, OCT2 ( Certains facteurs réagissent à des situations données (ex : protéines de stress thermique ou réponse aux glucocorticoides) Organisation Facteurs à doigt de zinc : ( Un atome de zinc interagit avec des amino acides de la protéine et forme un doigt. ( Les séquences d'acide aminé reconnaissent un motif d'ADN spécifique pour que ce motif se fixe sur la région de la régulation. [...]