Séquençage de l'ADN

Résumé du document

Ce document pdf présente les différentes méthodes de séquençage de l'ADN, ARN et protéines (méthode de Sanger, Southern, Western et Northern Blot)
Le séquençage de l'ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C'est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.

Extraits

[...] Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH en position 3'. Ainsi lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrête. Deux types de nucléotides triphosphates Le protocole Il faut préparer 4 mélanges: - le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité du fragment à séquencer = amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase Orienter cet ADN 15-25 nt L'ADN polymérase synthétise dans le sens 5' vers 3'. [...]

[...] aeruginosa Genome Array GeneChip‚ Not affected DOWN WT mutant Activated "DNA Chips " Génome de levure: 9337 données par réaction d'hybridation, soit pour une expérience type échantillons dupliqués) données analyse des données: normalisation, filtre puis détermination des profils Il est impératif de mettre en synergie les forces en présence (biologistes, mathématiciens et informaticiens) pour traiter cette quantité de données!!!!! Les biopuces sont des outils de choix pour les chercheurs, qu'ils fassent du séquençage, du génotypage, de l'analyse de l'expression des gènes ou encore de la pharmacogénomique. [...]

[...] puces à ADN (représentatives d'un génome) hybridées avec des ARN ou ADNc fluorescents 2. détection signal par un laser (automate) 3. traitement informatique des données Sptotted micro-arrays ADN sb ou db (100aine de bases) déposé par un robot sur une lamelle de verre spot = un gène) Une seule représentation Marquage différentiel des sondes -contrôle et test - par incorporation nt fluorescents (Cy3- et Cy5-dUTP) par reverse transcription Mélange des "sondes" et révélation d'un fluorophore puis de l'autre = niveau similaire d'expression RNA 1 + fluor RNA 2 + fluor RNA 1 + biot Chips oligonucléotides synthétisés in situ sur lamelle de verre gène = 15-20 oligont différents) 15-20 représentations RNA 2 + biot Marquage ARN par biotinylation 2 hybridations (sur 2 lames "Spotted micro-arrays" F. [...]

[...] Séquençage de l'ADN Définition Le séquençage de l'ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant. C'est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. Le séquençage selon la technique de Sanger Les ADN polymérases sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN, à partir d'un brin matrice. [...]

[...] Mélange d'AN à séparer (chargés négativement) 2. Dépôt sur gel d'agarose à 20kb) ou polyacrylamide 1000b) 3. Marqueur (tailles connues) 4. Champs électrique 5. [...]