Notion de base de techniques-stratégies d'analyse de l'ADN

Thèmes abordés

Sciences - Ingénierie - Industrie, Notion de base de techniques-stratégies d'analyse de l'ADN, hybridation, ADNc, marqueurs moléculaires, clonage, séquençage, ADN satellite, ADN nucléaire, chromosomes linéaires

Résumé du document

Concernant l'ADN nucléaire, 45% des séquences transposables sont capables de se déplacer. 5% sont des ADN satellites. 2% des exons sont des séquences codantes des protéines .45% sont autre chose (ARN non codant, introns, promoteur…). Les chromosomes sont linéaires chez la plupart des eucaryotes.

Extraits

[...] Purification des ARNm par chromatographie d'affinité La queue poly AA de l'ARNm est utile afin que le ligand se lie de façon covalente avec la présence de billes de –TTTTT. On fait passer les ARN totaux dans la colonne où le ligand immobilisé est présent. Seulement les ARN avec la présence de queue poly AA s'accroche à la résine. Lavage par du Na Cl Elution H2O afin de récupérer uniquement les ARN m Fabrication de cDNA à partir d'ARNm : Reverse transcriptase ( ADN polymérase donc besoin d'une amorce qui sera ici l'oligodT L'hybride ARN-ADN peut être directement utilisé pour la PCR. [...]

[...] - Elution du fragment à partir du gel d'agarose (=retire le fragment qui est sur le gel d'agarose) - Ligation du fragment et plasmide digéré Clone recombinant : 2 fragments (1taille plasmide 3kb + 1 taille du fragment cloné) Clone non recombinant : 1 fragment taille plasmide) - Transformation dans E. coli - Etalement sur gélose nutritive + ampi, Xgal et IPTG - Sélection des clones recombinants - Préparation de l'ADN plasmidique - Digestion par ? - Analyse par électrophorèse - Résultats attendus pour un clone positif et un clone négatif ? 7. Marqueurs moléculaires = révèle une différence entre 2 individus Certains marqueurs génétiques sont des marqueurs phénotypiques. [...]

[...] Taille amorce ex : amorce 4 bases = A C T G fréquence ¼ de chaque base donc ¼ x ¼ x ¼ x ¼ =1/256 fois tous les 256 bases) Ex : amorce 12 bases ( 17.106 toujours pas spécifique au génome humain ( 3.109 ) Ex : amorce 14 bases ( Ex : amorce 16 bases ( 4.10 = se rapproche trop du génome humain Ex : amorce 18 bases ( = utile pour génome humain pour être sur trouver une seule fois ( spécificité 3. Hybridation Principe Les séquences complémentaires s'hybrident après refroidissement. Southern blot (transfert d'ADN) Principe : ADN double brin digéré par une enzyme de restriction : obtention de plusieurs fragments. L'électrophorèse permet de séparer les fragments en fonction de leur taille. La dénaturation de l'ADN se fait dans une source alcaline à faible concentration. [...]

[...] Amorce en rouge : PCR avec les amorces sur l'ADN environnemental contenant l'ADN de toutes les espèces Séquençage des fragments amplifiés de toutes les espèces simultanément Analyse des séquences obtenus : identification des espèces présentes dans le milieu (car les séquences entre les amorces sont différentes entre chaque espèce) - Amplification de petit fragment : Le marqueur : - Doit amplifier de courts fragments d'ADN - Doit être adapté pour les différents groupes taxonomiques - Doit être très polyvalent (pour amplifier également les différentes ADN cibles) - Doit avoir une bonne résolution taxonomique (idéalement au niveau de l'espèce) Pas d'analyse d'individus Difficulté de distinguer des espèces proches Pas de sexage des individus Exemple protocole : - Collecte échantillon miel - Extraction de l'ADN - Amplification de l'ADN avec un couple d'amorces universel (PCR) - Contrôle de l'amplification par électrophorèse capillaire - Purification de l'ADN - Séquençage de nouvelle génération des produits purifiés - Analyse bio-informatique Pas de proportionnalité entre nombre d'individus d'une espèce présents dans le milieu et le nombre de séquences détectées par cette technique. [...]

[...] Si on veut ces ARN migrent en fonction de leur taille et non de leur forme : Formamide + chauffage à 65°C pour les rendre linéaire. Observation sur Gels Hybridation in situ Sur chromosomes : Pour localiser une séquence sur un chromosome, hybridation avec une sonde : Sonde : Transposon Hobo marqué avec un nucléotide fluorescent. Détection d'une translocation réciproque avec des sondes : - fragments ADN du chromosome 2 marqué avec un nucléotide fluorescent vert - fragments ADN du chromosome 11 marqué avec un nucléotide fluorescent rose Sur tissus : Hybridation sur ARN Western blot (transfert protéines) - Extraction des protéines à partir de cellules ou tissus - Dénaturation des protéines par chauffage à 100°C, en présence de SDS (sodium dodecyl sulfate chargé) et bêta-mercaptoethanol ou dithiothreitol - Séparation des protéines en fonctions de leurs tailles sur un gel de polyacrylamide et SDS (SDS-PAGE, technique de Laemmli) - Détection de la protéine d'intérêt avec un Ac spécifique (primaire) - Détection de l'Ac primaire par un Ac secondaire couplée à une enzyme - Détection de l'activité enzymatique avec un substrat 4. [...]