Mutation génétique et southern blot

Résumé du document

Compte-rendu de travaux pratiques de génétique, sur les mutations génétiques et les méthodes de caractérisation. Qu'est-ce que l'hybridation moléculaire et comment caractériser des mutants par la méthode du southern blot ?

Extraits

[...] Puis on effectue quatre dilutions successives des deux sondes, obtenues après PCR. D'après le dot blot, 1/100ème de sonde YBR correspond à 10pg/μl d'ADN. La sonde YBR260c contient donc 1ng/μl d'ADN. Et 1/100ème de sonde URA3 correspond à 100pg/μl ; cette sonde contient donc 10ng/μl d'ADN. Pour hydrolyser l'ADN double brin, on utilise l'enzyme de restriction Kpn1 qui le coupe au niveau des liaisons phosphodiester. Après avoir digéré l'ADN avec Kpn1, on obtient un mélange de très nombreux fragments de restriction dont les longueurs sont mesurées par électrophorèse sur gel d'agarose à côté d'un marqueur de masse moléculaire. [...]

[...] Enfin, l'ADN est lavé, séché et redissolu dans de l'eau stérile. Le dosage de l'ADN est effectué par spectrophotométrie, car les bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement dans l'ultraviolet à 260nm. Une unité de densité optique à 260 nm correspond à une solution d'ADN double brin à 50 μg/ml. Pour rechercher une éventuelle contamination protéique, on effectue une seconde mesure de DO à 280 nm (car les protéines absorbent à 260 et à 280 nm). Un ADN pur doit avoir un rapport DO260/DO280 compris entre 1,8 et 2. [...]

[...] La membrane obtenue est la réplique exacte du gel d'agarose. Une fois fixés, les brins ne peuvent pas se renaturer mais peuvent s'hybrider s'il y a complémentarité avec une sonde marquée. La première étape est la pré-hybridation, qui consiste à saturer la membrane de transfert d'ADN non spécifique pour réduire l'adsorption non spécifique de la sonde marquée sur la membrane. Il faut dénaturer la sonde pour qu'elle soit simple brin (comme l'ADN d'intérêt qui a été digéré, séparé, et dénaturé), puis elle est mise à incuber avec la membrane. [...]

[...] Le génotype de chaque souche est : ADN contrôle Sonde YBR 260c Sonde URA3 100pg/¼l 10pg/¼l 100pg/¼l 0,1pg/¼l 1pg/¼l 1/100000 1/10000 1/1000 1/100 A B C D A B C D 9,2 kpb 6,1 kpb 5,3 kpb 6,1 kpb Sonde URA3 Sonde YBR260c YBR260c+ ; URA3- YBR260c+ URA3- YBR260c+ ; URA3- ”YBR26100pg/μl 10pg/μl 100pg/μl 0,1pg/μl 1pg/μl 1/100000 1/10000 1/1000 1/100 A B C D A B C D 9,2 kpb 6,1 kpb 5,3 kpb 6,1 kpb Sonde URA3 Sonde YBR260c YBR260c+ ; URA3- YBR260c+ URA3- YBR260c+ ; URA3- ΔYBR260c ; URA3- ΔYBR260c ; URA3- YBR260c+ URA3- B A C D Electrophorèse sur gel d'agarose : les fragments séparés selon leur taille forment une traînée visible après coloration au bromure d'éthidium appelée SMEAR. M : marqueur de taille. C et D : les quatre souches de levures à identifier. [...]

[...] La DO à 260nm de 0,182 correspond donc à (0,182x50x250x10-3)= 2,275μg/μl d'ADN génomique. Ce résultat prouve l'efficacité de l'extraction . Pour visualiser une hybridation, il est nécessaire de marquer un acide nucléique d'un ADN simple brin qui prend alors le nom de sonde. Ici, on utilise un marquage non radioactif à la digoxygénine (sonde froide). La digoxygénine se révèle à l'aide d'un anticorps couplé à une protéine de fusion ayant une activité enzymatique propre comme la phosphatase alcaline. Le marquage est ensuite quantifié par dot blot. [...]