Les méthodes d'exploration en biologie cellulaire

Thèmes abordés

Méthodes d'exploration, biologie cellulaire, cellules in vitro, génotype, population cellulaire uniforme

Résumé du document

- Dissocier les cellules les unes des autres = enzymes, agitation.
- Obtenir population cellulaire uniforme = antigènes de surface reconnaissant glycoprot de surface.
. Distinguer types cellulaires = cytométrie de flux = regarder les cellules possédant antigène de surface, anticorps monoclonaux : étude expression à la mb plasmique, tri cellulaire facultatif et après comptage.
Anticorps Iaire = éviter erreurs
Anticorps IIaire = amplification du signal mais non spécifique
. Trier les cellules par fluorescence activée = FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) = cytométrie en flux = généralement pas de perméabilisation sauf pour voir ce qui est à l'intérieur de la cellule (marqueur intracytoplasmique).

Extraits

[...] METHODES D'EXPLORATION Isoler et cultiver des cellules in vitro Isoler les cellules Dissocier les cellules les unes des autres = enzymes, agitation Obtenir population cellulaire uniforme = antigènes de surface reconnaissant glycoprot de surface Distinguer types cellulaires = cytométrie de flux = regarder les cellules possédant antigène de surface, anticorps monoclonaux étude expression à la mb plasmique, tri cellulaire facultatif et après comptage Anticorps Iaire = éviter erreurs Anticorps IIaire = amplification du signal mais non spécifique Trier les cellules par fluorescence activée = FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) = cytométrie en flux = généralement pas de perméabilisation sauf pour voir ce qui est à l'intérieur de la cellule (marqueur intracytoplasmique) cellules incubées avec anticorps (souvent un seul couplé à un fluorochrome, FITC souvent) ou colorants spécifiques, séparées par vibration de manière individuelle ds des gouttelettes, passent devant un laser qui émet signal d'excitation, émission détectée par détecteurs (possibilité de détecter plusieurs longueurs d'onde), champ magnétique sépare les cellules en 3 gpes - et amas indistincts), permet d'estimer taille et granulosité Microdissection laser Cellules primaires et lignées cellulaires Culture primaire = peu de prolifération, varie en type cellulaire Lignée cellulaire (immortalisée, cancéreuse) = à partir de cellules cancéreuses, ou introduction gène codant pour télomérase, ou transformation virale (oncogènes), divisions cellulaires rapides Obtention d'anticorps Anticorps monoclonaux = vaccination de souris, recueil des LB, fusion LB sain + LB cancéreux hybridome, isolation cellules de proche en proche, obtention d'une lignée fabriquant des anticorps monoclonaux spécifiques (reconnaissance d'une protéine sur un seul épitope) Anticorps polyclonaux = vaccination d'un animal, prélèvement de son plasma, obtention de plusieurs cellules qui fournissent anticorps polyclonaux (plusieurs Ig qui reconnaissent prot sur épitopes) II] Etudier l'expression des gènes génotype Rappels Exon = aa protéique = partie codante (transcrits et traduits) / Intron = partie non codante (transcrits mais non traduits) n exons pour n-1 introns ARN pré-messager maturé en ARNm mature = ajoût coiffe 7-méthylglutamate en + signal polyadénnylation (queue polyA pr ts ARNm) en (protection contre dégradation) + épissage introns ARNm mature sort du noyau, traduit par ribosomes dans REG La RT-PCR quantitative (remplace Northern Blot)= technique semi-quantitative La transcription reverse = à partir d'une amorce polyT et d'une reverse transcriptase dble brin dpdte = dégradation ARN puis synthèse ADN complémentaire de tous les ARNm (car ADN plus stable) Amplification par PCR du gène = séparation des 2 hélices de ADN par chauffage + hybridation amorces spécifiques du gène que l'on veut étudier + fabrication brin complémentaire grâce à TAC polymérase dble brin dpdte) 220-240 fois plus de molec qu'au départ Quantification relative par SYBR-Green = prot qui s'intercale entre bases des dbles brins d'ADN et devient fluorescente si on mesure la fluorescence, on mesure la qté d'ADNc fabriquée, on peut donc déterminer de manière semi-quantitative (combien de fois plus ou moins) la qté d'ARNm ou d'ADN de départ (RT-PCR ARN ; PCR ADN) Southern Blot = PCR pour ADN, Northern Blot = PCR pour ARN Standard interne = contrôle de charge = protéine dont expression ne varie presque pas (β-actine ou GAPDH) Normalisation = semi-quantitatif (sur 100 ou sur pas d'unités) = pas de comparaison Condition contrôle = par rapport aux tests statistiques et non à la normalisation N'informe pas sur le niveau de différenciation mais permet de faire des statistiques ou que) La régulation de l'expression des gènes = promoteurs Différents contrôles : transcription, édition ARN (ex : ApoB100 foie / ApoB48 intestin), transport, localisation (séquence 3'UTR), stabilité (queue polyA), dégradation, traduction, activité protéines Contrôle de la traduction protéique miRNA (naturel) + siRNA (synthétique) transfection transitoire miRNA = naturel, clivage ARNm ou inhibition (fixation sur partie monocodante) inhibe traduction, appariement total ou partiel chaque miRNA paut se fixer sur 100 gènes, tissu spécifique car promoteur tissu dpdt siRNA = synthétique, ne fait que cliver et pas inhiber Mécanisme : Clivage queue polyA dans noyau Clivage miRNA double brin au niveau de la boucle par ribonucléase Dicer puis prise en charge par complexe enzymatique RISK miRNA + RISK se fixe sur ARNm cible, ce qui entraîne la coupure et la dégradation de ARNm Dégradation totale (traduction inhibée des cas) ou partielle (traduction réduite, fixation imparfaite, ARNm conservé) ARN interférence (dble brin) = mécanisme pour inhiber expression d'un gène, phénomène posttranscriptionnel Dominant = prot active ou inactive que l'on fait exprimer dans une cellule (cellule dominante va entraîner modif positives ou négatives dans ttes les voies de signalisation ds lesquelles elle est impliquée) III] Etudier l'expression des protéines protéines Le Western Blot = technique (semi)-quantitative Accès au phénotype (ex : hypertrophie = cellule plus grosse) Technique SDS-PAGE = traitement des prot au sodium-dodécyl-dulfate (dénaturation + charge séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, prot migrent vers anode en de leur pds moleculaire (plus vite pour petites prot) Immunoblot = après SDS-PAGE, transfert des prot sur une membrane de nitrocellulose chargée incubation dans une solution aqueuse avec un anticorps (mono ou polyclonal) qui reconnaît la prot fixée spécifiquement (anticorps primaire = HbG, vaccination animal contre prot humaine + anticorps 2ndaire spécifique du 1er attaché à une enzyme pour fabrication signal) cellules broyées, donc étude de l'expression dans l'ensemble de la cellule Autres techniques ELISA = on fixe des anticorps monoclonaux spécifiques, et on ajoute un mélange contenant les prot fixation), puis on ajoute un 2e anticorps qui reconnaît la protéine par un autre épitope, et enfin un 3e spécifique du 2e couplé à une enzyme pour détection = technique quantitative Les protéines chimères = gène χ + gène GFP transcription traduction protéines chimères fluorescentes (prot χ + prot GFP) Localisation subcellulaire = pour protéines endogènes non fluorescentes = fixer (retirer lipides) et perméabiliser (trouer la membrane) la cellule pour faire rentre des anticorps (Ac Iaire + IIaire ac fluorescence ou Ac Iaire directement couplé à fluorescence) microscopie photonique, colocalisation (superposition de 2 signaux) Immunohistochimie = cellules fixées c-à-d qu'elles n'évoluent plus dénaturées) Microscopie confocale seule = observer marquage ds mb plasmique Sur images = qualitatif seulement (item vrai si on a semble IV] Physiologie intégrée, génétique Rappels de génétique Allèles/gènes sauvages ou mutés, individus homo ou hétérozygotes phénotypes Méiose = crossing-over (recombinaison homologue) Mutations : substitution, délétion ou insertion (décalage cadre de lecture codon STOP prématuré) souvent perte de fonction, mais parfois gain de fontion, ou perte de fonction conditionnelle (ne s'exprime que ds certaines conditions) Lois de Mendel = homogénéités des hybrides de la 1e génération + pureté des gamètes + ségrégation idpdte des caractères héréditaires Mutagenèse dirigée = transfection plasmidique Cellules non fixées Transfection plasmidique = insertion ADN ou ARN dans cellules pour exprimer un transgène Plasmide = structure d'ADN dble brin circulaire issu de bactéries possédant un promoteur fort (souvent dans les virus) Clonage de l'ADNc, transfection en trouant la membrane Expression de ADNc sous forme d'ARNm surexpression protéine Mutagenèse dirigée = modif de qq bases, production par les cellules de protéines mutées = dénaturation ADN par chauffage, synthèse oligonucléotide complémentaire portant la muation au milieu, hybridation au plasmide, production protéine identique sauf pr cet aa Transgenèse Transgenèse = surexpression d'un gène dans un animal Microinjection de fragments d'ADN (transgène avec promoteur fort) ds ovule fécondé stade 2 protonucléi ADN s'insère de manière aléatoire et hétérologue (n'importe où) dans le génome Insertion dans une mère porteuse 10-30% des souriceaux ont ces gènes dans leur génome = lignées de souris transgéniques Les souris knock-out Souris = seul mammifère sur lequel on peut enlever un gène Fabrication cellules ES recombinantes : dans cellules souches embryonnaires SV129 capables de recombinaison homologue (comme chez les bactéries) : Fabrication d'un vecteur sur lequel on place gène de résistance à l'antibiotique néomycine (NEO) et un autre gène de sensibilité au gangyclovir Recombinaison homologue (rare, formation de cellules ES recombinées possédant NEO mais pas TK cellules résistantes à la néomycine et au gancyclovir) ou non homologue (cellules ES recombinées possédant NEO et TK cellules résistantes à la néomycine et sensibles au gancyclovir) Sélection positive (traitement à la néomycine) et négative (traitement au gacyclovir) Electroporation d'un blastocyste de souris C57BL/6 dans lequel on veut détruire X Injection cellules ES totipotentes recombinantes dans blastocèle Implantation dans une mère porteuse obtention de souriceaux noirs ou chimères Croisement souris chimérique x souris noire on obtient des souris toutes noires ou toutes marrons, on croise donc les souris marrons entre elles pour identifier les souris hétérozygotes pr X On réalise ensuite plusieurs croisements pour obtenir des souris KO Etude des processus cellulaires : résumé Partir d'un phénotype dysfonctionnel pour découvrir le gène impliqué génétique. [...]

[...] Surexprimer ou inhiber l'expression de la protéine sauvage ou mutée dans des cellules en culture pour comprendre son rôle fonctionnel culture cellulaire, clonage, mutagenèse dirigée, transfections. [...]

[...] Déterminer la localisation subcellulaire de la protéine sauvage et mutée microscopie, anticorps, protéines de fusion, cytométrie de flux. [...]

[...] Surexpression plasmide. [...]

[...] Inhibition siRNA (inhibe la traduction prot) Mesurer la structure et l'activité (enzyme) ainsi que les partenaires de la protéine in vitro biochimie. [...]