Les méthodes de séparation des mélanges en Biochimie

Résumé du document

Pour étudier une molécule qui se trouve dans un mélange, il est nécessaire d'effectuer une séparation. Nous allons détailler les méthodes disponibles, leurs avantages et inconvénients.

La Précipitation

Le mélange est transformé en un précipité peu soluble qui sera ensuite filtré, purifié et transformé en un produit dont on connaît la composition (...)

Extraits

[...] Nous allons détailler les méthodes disponibles, leurs avantages et inconvénients. I. La précipitation Le mélange est transformé en un précipité peu soluble qui sera ensuite filtré, purifié et transformé en un produit dont on connait la composition. a. Par les sels On ajoute du sulfate d'ammonium (NH4)2 SO4 qui est la solution la plus employée. C'est un sel très soluble et permet l'obtention d'une force ionique importante. Il déshydrate les protéines, les ions sulfate, petits peuvent aisément s'approcher des protéines pour les neutraliser. [...]

[...] II. L'adsorption C'est une technique qui utilise les caractéristiques de la surface des protéines de lier plus ou moins irréversiblement des molécules. On utilise cette technique principalement pour récupérer et régénérer des solvants. Cette méthode consiste en la séparation des constituants d'un mélange grâce à leur affinité avec la phase fixe. a. Par échange d'ions La phase fixe est constituée en un réseau poreux, avec des charges électriques en excès qui sont compensées par la présence d'ions de charges opposée. [...]

[...] Les protéines sont éluées en diminuant la concentration des sels(les interactions diminuent) ou avec un détergeant qui solubilise les liaisons. c. Chromatographie d'affinité On s'appuie sur l'interaction ligand protéines. Le support contient le ligand (attaché par liaison covalente, pour que seule la protéine fixant le ligand ne soit retenue). L'élution n'est en premier, pas spécifique, on utilise simplement la force ionique puis en second, on libère le complexe ligand-protéine que l'on dialyse ensuite, pour obtenir la protéine libre. d. Immuno-absorbant Un antigène est fixé sur la phase fixe pour purifier l'anticorps. [...]

[...] La séparation en solution a. Filtre sur gel La séparation se fait en fonction du poids moléculaire de la molécule (les plus petites sont retenues en pénétrant dans les pores du gel). La révélation se fait après coloration des protéines avec du bleu d'Aniline ou du bleu de Comassie en présence d'un fixateur acide le TCA (acide trichloracétique) ou par la coloration d'un composé chimique associé à la protéine. Le dispositif est fait d'un gel (poly_acrylamide) dans lequel on dépose l'échantillon. [...]