L'isolement et la séparation des acides nucléiques

Résumé du document

Méthode :
- Purification des lymphocytes
Prélèvement de sang
Isolement des composants par centrifugation sur un gradient de Ficoll
Lavage par une solution salée : élimination du Ficoll

- Lyse des cellules
Utilisation de 2 méthodes en parallèle :
1. broyage
2. Méthode osmotique (milieu hypotonique pour faire éclater les cellules) (...)

Extraits

[...] Gel = réseau dont la taille des mailles varie proportionnellement à la concentration. Utilisation de l'électricité pour faire migrer les molécules (chargées Electrophorèse d'ADN sur gel d'agarose Concentration d'agarose [ ; Séparation de fragments de taille є [50 ; 30 000] pb ( pour des fragments + petits ( utilisation d'acrylamide, concentration ; molécules de taille є ; 500] pb. Utilisation d'un colorant (contenant du glycérol) : Alourdi les molécules Marque le front de migration Utilisation de marqueur de taille pour déterminer la taille relative des fragments. [...]

[...] o Isolement des composants par centrifugation sur un gradient de Ficoll o Lavage par une solution salée ( élimination du Ficoll Lyse des cellules. Utilisation de 2 méthodes en parallèle : 1 broyage 2 Méthode osmotique (milieu hypotonique pour faire éclater les cellules) o Utilisation d'EDTA = chélateur d'ions divalents Ca2+) nécessaires au fonctionnement des nucléases (dégradent l'ADN) o Utilisation de SDS (détergent) pour dégrader les membranes et dénaturer les protéines. o Utilisation de la protéinase K (protéase) pour dégrader les protéines. Purification des acides nucléiques. On place la solution précédente dans du Phénol. Or : protéines solubles dans le Phenol. [...]

[...] Froid + force ionique du milieu = favorisation de la précipitation d'ADN ( obtention d'une méduse d'ADN Lavage de l'ADN Réalisé en présence d'éthanol 70% ( évacue le NaCl de la solution. Obtention d'un culot d'ADN séché dans l'air puis dissous dans l'eau. Extraction d'ARN. ARN beaucoup + sensible à la dégradation par les nucléases. Utilisation de l'isothiocyanate de guanidium (capte les ions divalents) et du (-mercapthoéthanol (détergent dégradant les nucléases) à la place de l'EDTA. Utilisation de l'isopropanol pour précipiter l'ARN. [...]