Immunologie appliquée

Thèmes abordés

Immunologie appliquée, cellules mononuclées, PBMC, in vitro, frottis sanguin humain, hémogramme

Résumé du document

Les superantigènes sont des produits d'origine virale ou bactérienne qui constituent de puissants activateurs des lymphocytes T αβ (prolifération et production de cytokines). Ils se distinguent des Antigènes T conventionnels par leur capacité à stimuler de forte proportion de lymphocytes T de manière dépendante de l'expression de segments Vβ particuliers.
L'objectif de ce TP est d'analyser la capacité du SEA (Staphyloccocal Enterotoxin A) à stimuler des cellules mononuclées du sang périphérique humain.

Extraits

[...] L'objectif de ce TP est d'analyser la capacité du SEA (Staphyloccocal Enterotoxin à stimuler des cellules mononuclées du sang périphérique humain. Matériel de biologie cellulaire : Les manipulations doivent être réalisées avec des gants Sang humain : Le sang provient de l'EFS de Nantes Ficoll (GE healthcare) densité : 1,077 SEA : concentration = 10µg/mL (Sigma Aldrich ref S93399) LeucoA : concentration 1mg/mL Cellule de comptage type Mallassez Agent d'exclusion des cellules mortes : éosine Plastiques de culture (tube falcon 15 mL, pipettes) Milieu de culture pour cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC): RPMI 1640 supplémenté en 10%SVF glutamine, IL- IU/mL Matériel de Biologie Moléculaire Colonne d'extraction RNA Kit de reverse transcription : MMLV RTase, dNTP, oligodT, tampon reverse transcription PCR : Taq DNA polymerase, dNTP, oligonucléotides Isolement des cellules mononuclées du sang périphérique Travailler avec des gants ! [...]

[...] Le volume total sur cette surface est de 1 mm3. Vous pouvez donc calculer le nombre de PBMC récupérés (en cellules par mL) 3 III/ Stimulation des PBMC in vitro Disposer 5.106 PBMC de milieu de culture dans un puits de plaque 48 puits selon le plan suivant Ligne 1 Ligne 2 Ligne 3 Binome A1 Binome A2 Binome B1 Binome B2 Binome C1 Binome C2 Binome D1 Etc 3 conditions sont testées : PBMC seuls : ligne 1 PBMC en présence de SEA : Ligne 2 PBMC en présence de Leuco A : Ligne 3 Le volume final par puits doit être de 300µL La concentration de SEA finale est de 100ng/mL La concentration finale de LeucoA est de 1µg/mL En fonction de la position de vos PBMC sur la plaque ajouter les produits nécessaires. [...]

[...] En laboratoire spécialisé, la numération s'effectue à l'aide d'automates (comptage d' environ cellules). Les appareils travaillent sur de très petit volume (50 µl ou moins), il est donc possible d'effectuer les numérations sur des prélèvements micro capillaires (au bout du doigt). Ceci est très utile chez l'enfant ou chez les patients ayant des veines difficiles d'accès. Les examens sont effectués à partir d'un prélèvement sanguin, le plus souvent sur EDTA qui est un chélateur du calcium. Ceci évite la formation de caillot dans le tube. [...]

[...] Dans le tube PCR déposer 23µL d'un des MIX (soit ajouter 2µL d'eau distillée Placer les tubes dans la machine à PCR PCR : 35 cycles 94°C 30'', 55°C 30'', 72°C 1' IV-4 Electrophorèse en gel d'agarose Couler un gel d'agarose de pour 3 personnes (12 tubes PCR) Sur chaque gel placer charger dans l'ordre 10µL des PCR réalisés à partir des PBMC non stimulés, des PBMC stimulés SEA et des PBMC stimulés par la LeucoA. Marqueur de taille : 5µL dans un puit 6 TP2: Etude du frottis sanguin humain Partie théorique (p1 à p13) Notions de base sur l'hématopoïèse (cellules souches et précurseurs hématopoïétiques) figure 1. Méthodes d'étude des cellules du sang : L'hémogramme (numération sanguine, formule leucocytaire, frottis sanguin, coloration au May-Grünwald-Giemsa :MGG). Principales caractéristiques des différentes cellules sanguines colorées par le MGG. Interprétation de l'hémogramme : - Constantes érythrocytaires. - Anomalies des GR. [...]

[...] Dans un tube disposer : 8,5µL d'ARN 2,5µL d'oligodT (250ng/mL) 1µL de dNTP (10mM each) Incuber le mélange 5 min à 65°C et placer le tube immédiatement sur glace Centrifuger brièvement pour faire tomber le mélange au fond du tube Ajouter 4µL de tampon 5X Mix RTase 2µL de DTT 0,1M mélanger et incuber 2 min à 37°C Ajouter 1µL de MMLV-RétroTranscriptase Incuber 50 min à 37°C Inactiver 15 minutes à 70°C IV-3 PCR Chaque étudiant va réaliser 4 PCR différentes à partir de son échantillon d'ADNc Numéroter des tubes PCR de 1 à 4 Mix PCR 5 : amplification d'un cDNA issu d'un gène ménage : amplification d'un fragment de cDNA du TNF : amplification d'un fragment de cDNA du gène BV13 : contrôle négatif MIX : les Mix sont déjà préparés de la façon suivante Pour 50µL 5µL de MIX 10x 1,5µL de MgCl2 (50mM) 1µL de dNTP (10mM) 1µL primer sens (10µM) 1µL primer antisens (10µM) 0,5 µL Taq DNA polymerase (5U/µL) 38 µL d'eau distillée prélever 23µL de chacun des MIX dans un tube PCR, ajouter 2µL de cDNA dans chaque tube. Excepté dans le tube PCR contrôle. Prélever 23µL de Mix déposer dans le tube PCR ajouter 2µL de cDNA. Prélever 23µL de Mix déposer dans le tube PCR ajouter 2µL de cDNA. Prélever 23µL de Mix déposer dans le tube PCR ajouter 2µL de cDNA. Prélever 23µL de Mix déposer dans le tube PCR ajouter 2µL de cDNA. [...]