Biologie moléculaire : identification de bactéries par PCR

Résumé du document

Au cours du TP de Biologie moléculaire nous avons été initiés à des techniques de biologie moléculaire (la PCR simple et la PCR multiplex) appliqués aux industries agroalimentaires pour l'identification des bactéries.

Extraits

[...] Les Campylobacter sont des bactéries Gram - thermotolérants. La technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) permet une recherche rapide de leur présence dans les aliments et l'obtention directe de l'information sur l'espèce de Campylobacter présente, à la différence des méthodes classiques qui sont longues. Extraction de l'ADN chromosomique de souches de Campylobacter On prélève à l'aide d'un écouvillon une colonie dans les cultures sur boîte fournies et on prépare une suspension dense dans de l'eau distillée. La suspension est ensuite portée à ébullition 10 minutes afin de faire éclater la membrane cellulaire et libérer l'ADN. [...]

[...] Le chois de deux amorces est nécessaire car on veut seulement répliquer une partie du gène pnpA. Les amorces travaillent uniquement dans le sens 5' 3' et doivent être complémentaires du brin à répliquer. L'amorce 1 aura donc la même succession de nucléotides que celle du brin présenté, contrairement à l'amorce 2 qui aura une succession de nucléotides correspondant au brin complémentaire. L'amorce 1 et l'amorce 2 devront avoir la même température d'hybridation (Tm). Cette température est calculée par la formule suivante : Tm = + On obtient donc : Amorce 1 : 20 nucléotides : ATTATTGCGGCAGTTGGTAA Tm = 2 + 4 Tm = 56°C Amorce 2 : 20 nucléotides : GCATTTCGAAACGAACTCTT Tm = 2 + 4 Tm = 56°C Le cycle de PCR à appliquer est donc : - dénaturation initiale : 95°c 5min - * dénaturation : 95°C 1min * hybridation : 56°C 1min * élongation : 72°C 1min - élongation terminale : 72°C 5min Si = 1kb 1min Si [...]

[...] Ce tampon nous servira à la préparation du gel et sera utilisé comme tampon de migration. Dans un erlenmeyer de 200 ml, nous avons pesé 0,75g d'agarose et ajouté 50ml de tampon TAE 1X préalablement préparé. Le mélange est ensuite porté à ébullition jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondu. Après avoir préalablement nettoyé la cuve et les accessoires à l'alcool, nous avons effectué le montage et coulé le gel. Le gel est ensuite mis en immersion dans le tampon de migration. [...]

[...] Le témoin négatif ne contient aucun ADN à amplifier. Notre expérience sera valide, si et seulement si, le témoin négatif ne fait apparaître aucune bande de migration. Photographie de la migration des échantillons, du témoin négatif, du mélange et des marqueurs de poids moléculaire Les marqueurs de poids moléculaire permettent de déterminer la taille des fragments d'ADN amplifiés par PCR. La distance de migration des fragments dans le gel s'effectue en fonction de leurs poids moléculaires. Le graphique Log de paires de bases en fonction de la distance de migration donne une droite qui permet de retrouver le poids moléculaire des fragments amplifiés. [...]

[...] En traçant la courbe log du poids moléculaire en fonction de la distance de migration, on peut identifier les souches. II] Identification des bactéries lactiques par PCR ITS Les bactéries telles que les bactéries lactiques sont très souvent utilisées en tant que bactéries alliées dans les process de fabrication de produits alimentaires. Mais certaines sont des bactéries d'altération que l'on souhaite détecter rapidement. La méthode PCR - ITS (Internal Transcribed Segment) propose de réaliser qu'une identification rapide de souches des genres Carnobacterium, Lactobacillus et Leuconostoc. [...]