L'hybridation moléculaire

Thèmes abordés

Hybridation moléculaire, ADN, biologie moléculaire, acides nucléiques, séquences, chromosomes

Résumé du document

Elle permet de repérer l'ADN mais pas de l'isoler.
C'est une autre technique fondamentale en biologie moléculaire.
Cette technique est basée sur la capacité des acides nucléiques simple brin à s'associer pour former une molécule double brin.
Pour que ceci puisse se produire la complémentarité des séquences doit être importante pour que des liaisons hydrogènes en nombre suffisamment grand puissent s'établir entre les 2 brins d'ADN suivant le principe de la complémentarité des bases AT GC.

Extraits

[...] L'hybridaton moléculaire Elle permet de repérer l'ADN mais pas de l'isoler. C'est une autre technique fondamentale en biologie moléculaire. Cette technique est basée sur la capacité des acides nucléiques simple brin à s'associer pour former une molécule double brin. Pour que ceci puisse se produire la complémentarité des séquences doit être importante pour que des liaisons hydrogènes en nombre suffisamment grand puissent s'établir entre les 2 brins d'ADN suivant le principe de la complémentarité des bases AT GC. Les méthodes d'hybridation utilisent des acides nucléiques que l'on va marquer. [...]

[...] Les fragments sont séparés suivant la taille. Ensuite on retire le gel et on le place sur un support spongieux (dans un tampon dénaturant pour séparer les fragments), puis une membrane de cellulose, un papier et un poids. On a une montée par capillarité des fragments d'ADN qui traversent le gel pour venir se plaquer sur la membrane de cellulose. La membrane, qui contient l'empreinte de ce que l'on a vu, est mise dans un tampon qui contient les sondes qui repèrent alors des séquence spécifique. [...]

[...] II Facteurs de l'hybridation C'est d'abord la température de fusion = Tm. Elle correspond au point d'inflexion de la courbe de fusion où il y aura 50% de l'ADN sous forme simple brin et 50% d'ADN sous forme double brin. Cette température est primordiale qui influence et qui a un rôle sur toutes les techniques d'hybridation. La température de fusion est différente d'un brin d'ADN à l'autre selon qu'il contient plus de GC, ou moins de GC. Comme il y a 3 ponts H entre G et C ils sont plus difficiles à séparer que quand il est riche en AT. [...]

[...] IV Applications de l'hybridation 1. Hybridation d'ADN sur support solide Une application principale utilisée en maladies génétiques c'est le Southern Blot. Il tire son nom de Mr Southern qui l'a inventé. Cette technique a plusieurs étapes : Isoler le morceau d'ADN Ensuite on va couper ce morceau d'ADN en utilisant des enzymes de restriction Après coupure on sépare les fragments par électrophorèse en fonction de leur taille et de leur PM. On transfère ces fragments sur un gel On traite la membrane à la soude pour rendre l'ADN simple brin et ensuite on met une sonde qui reconnaît uniquement certains fragments. [...]

[...] Ces sondes ont été obtenues par clonage au tout début (par l'intermédiaire des plasmides). L'apparition des techniques de PCR permet de s'affranchir de cette méthode donc les sondes sont préparées par PCR directement amplifiées à partir de l'ensemble du patrimoine génétique d'un individu. IV Marquage des sondes Une sonde doit être marquée. L'agent de marquage peut être de différentes natures. Il peut être radioactif ou froid. Les sondes radioactives Quand il est radioactif, la plupart du temps il est marqué soit au phosphore 32 et avant le soufre 35 ou au tritium. [...]