Génétique moléculaire : diagnostic direct et indirect

Thèmes abordés

Génétique moléculaire, diagnostic direct, diagnostic indirect, analyse moléculaire, anomalie chromosomique

Résumé du document

Analyse cytogénétique : cherche des anomalies d'ordre chromosomique alors qu'une analyse moléculaire cherche des anomalies plus petites à l'échelle de l'ADN (mutations ponctuelles, délétions...).
La mutation entraîne une fonction anormale ou absente, mais les mutations ne rendent pas forcément le gène inactif, cela peut donner un gène avec une activité supérieure à la normale.
Les mutations se trouvent majoritairement au niveau des exons (séquences codantes), mais on peut aussi en trouver au niveau des introns ou des régions promotrices 3' ou 5'.
Les gènes comme les exons sont de taille très variable, il faut donc avoir fait si possible au préalable un diagnostic clinique chez le patient pour faciliter les recherches faites en cytogénétique moléculaire.

Extraits

[...] Le criblage permet d'augmenter le débit et de réduire les coûts par rapport au séquençage direct sans diminution de sensibilité. Détection des hétéroduplex : Technique DDGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) = les premiers complexes à se séparer si on les chauffe sont les hétéroduplex (hétérozygotes), on repère donc les fragments qui dans produit de PCR se dénaturent plus rapidement et on les séquence. Technique dHPLC = méthode chromatographique en phase liquide, établissement de profils spécifiques de migration/élution selon le type de mutation mais ne détecte pas les homozygotes mutés. [...]

[...] Polymorphismes : variations de la séquence des gènes résultant en de légères différences entre les individus. Normalement pas de conséquences pathologiques, car une protéine peut être tronquée mais si les acides aminés perdus ne sont pas impliqués dans la fonction de la protéine il n'y aura pas de conséquences, sauf dans certains cas. C'est en Afrique que l'on a la plus grande diversité, et certains codons stop sont considérés comme un polymorphisme car on les retrouve beaucoup dans la population et qu'ils sont compatibles avec une vie normale. [...]

[...] Exemple d'utilisation du diagnostic indirect en diagnostic : demande de DPN dans une famille d'hémophilie A utilisation de marqueurs microsatellites intragéniques (dans le gène du facteur 8 sur le chromosome si la future maman n'est pas porteuse de la mutation le généticien n'a pas lieu de proposer un DPN, si elle est porteuse on effectue d'abord une prise de sang pour connaître le sexe du fœtus, et uniquement si c'est un garçon on réalise l'amniocentèse. Avantages : Diagnostic rapide. On n'a pas besoin de connaître parfaitement le gène, il suffit du locus. Très utile quand on a un grand gène Ex : Myopathie de Duchenne : gène de 2.3 Mb. Très fiable si toutes les conditions sont réunies : risque d'erreur faible et calculable. On n'a pas toujours besoin du cas index pour pouvoir conclure (on procède par élimination) Inconvénients : On ne voit pas l'anomalie de façon directe. [...]

[...] Génétique moléculaire : diagnostic direct et indirect Introduction Analyse cytogénétique : cherche des anomalies d'ordre chromosomique alors qu'une analyse moléculaire cherche des anomalies plus petites à l'échelle de l'ADN (mutations ponctuelles, délétions . ) La mutation entraîne une fonction anormale ou absente, mais les mutations ne rendent pas forcément le gène inactif, cela peut donner un gène avec une activité supérieure à la normale. Les mutations se trouvent majoritairement au niveau des exons (séquences codantes), mais on peut aussi en trouver au niveau des introns ou des régions promotrices ou 5'. [...]

[...] Homme mutée : méthylation complète de son X donc l'ADN n'est pas coupé par EagI. Séquençage direct selon la technique de Sanger : recherche de mutations ponctuelles, petites insertions ou délétions. Principe : applicable aux mutations connues comme inconnues . Après une étape de PCR initiale, on met dans les tubes de réaction de séquence un mélange de 90% de dNTPs et 10% de ddNTPs marqués par des fluorochromes avec un fluorochrome par base (pas d'élongation possible après hybridation d'un ddNTP). Ensuite on révèle le tout grâce à détection fluorescente sur une seconde PCR. [...]