Préparation d'un extrait enzymatique

Résumé du document

Pour les protéines extra-cellulaires, on procède à une purification directe.
Pour les protéines intra-cellulaires, il faut libérer le contenu cellulaire en cassant les membranes plasmiques.

- La méthode douce : On commence par faire subir un choc osmotique (changement brutal de température, pression (...) qui fait éclater les membranes, puis on ajoute des lysozymes (qui détruisent les bactéries) (...)

Extraits

[...] Le pouvoir du tampon est maximal lorsque le pH de la solution étudiée est égale au pKa du tampon et ce pouvoir augmente lorsque sa concentration [tampon]) augmente. Exemple de quelques tampons fréquemment utilisés : Tampon acétate : Tampon Mops : Tampon succinate : Tampon Tris : [ 8,08] Tampon MES : Tampon Ethanolamine : Tampon phosphate : IV. La stabilisation Il faut inactiver les protéines inintéressantes et protéger celles à étudier. Les mécanismes d'inactivation des protéines : La dénaturation, qui leur fait perdre leur structure tertiaire (elles se déplient). [...]

[...] du sang : albumine, facteurs de coagulation . des végétaux de micro-organismes : bactéries . La congélation de ces extraits est possible, la production de micro- organismes est aisée. On récupère des cellules, issues de ces sources, par filtration (filtration sur nitrate de cellulose) puis par centrifugation entre 1000 et 20000G (qui accélère la sédimentation). II. L'homogénéisation Pour les protéines extra-cellulaires, on procède à une purification directe. Pour les protéines intra-cellulaires, il faut libérer le contenu cellulaire en cassant les membranes plasmiques. [...]

[...] La classification / la concentration Les méthodes utilisées pour éliminer les sels sont : la dialyse : avec un seuil de rétention inférieur à 5Kpa, les protéines sont retenues tandis que les sels passent ainsi que les toutes petites molécules de l'extrait. L'ultra-centrifugation : grâce à une membrane poreuse, elle filtre les protéines puis on fait une dialyse pour éliminer les sels restants. Le dessalage : on tamis (par filtration sur gel) pour séparer les sels et les petites molécules. On utilise une colonne avec gel, la séparation est plus rapide. L'échantillon est prêt à être étudier. [...]