Techniques d'analyses biochimiques

Résumé du document

Si la molécule est intracellulaire, il faut une extraction puis une purification.
Si la molécule est extracellulaire, il faut une purification simplement.
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Extraits

[...] Après l'extraction enzymatique, on revient aux extractions chimiques pour finir la lyse. Extractions mécaniques Homogénéisateur de type Dounce C'est une éprouvette épaisse accompagnée d'un pilon permettant de broyer l'échantillon qui peut être préalablement congelé pour faciliter le broyage. La presse Amino-French C'est un piston formé d'anneaux en caoutchouc que l'on visse dans une chambre. Plus le piston est enfoncé, plus la pression est forte, plus la lyse est totale. Puis on ouvre la valve vers le bas de la chambre et la cellule est violemment projetée au travers d'un tuyau plus petit. [...]

[...] Phase stationnaire : Elle peut être en colonne (support inerte imprégné de la phase stationnaire), en couche mince (support inerte coulé sur une plaque), sur papier (cellulose, l'humidité est présente dans le papier). Phase mobile : C'est un solvant organique ou mélange. La phase est apolaire. HPLC L'HPLC est constitué de 6 éléments : Un réservoir à phase mobile : Les phases mobiles sont choisies en fonction de la colonne. On peut relier jusqu'à 4 phases mobiles (réservoirs) différents ce qui permet de faire des gradients entre les différentes phases. La pompe : Elle sert à avoir un débit régulier et homogène, de plus que la pression dans le système est forte. [...]

[...] Sinon, il faut réaliser une révélation universelle (pulvérisation avec de l'acide sulfonique + chauffage >100°C ce qui permet aux molécules carbonées d'apparaître en noires mais les molécules sont détruites et il est impossible de les récupérer) ou utiliser un révélateur général qui est spécifique des molécules (ninhydrine pour les acides aminés). Rf = Distance parcourue par le soluté Distance parcourue par la phase mobile Un soluté fortement adsorbé aura un Rf faible. Le Rf est caractéristiqued'une molécule. -Chromatographie bidimensionnelle. Elle permet d'augmenter le pouvoir séparateur de la C.C.M. On a une première C.C.M classique à une dimension avec une phase mobile puis une deuxième migration avec une autre phase mobile sur la plaque tourné de 90°. [...]

[...] avant de choisir la technique de purification adéquate. L'Extraction Elle ne concerne que les molécules intracellulaires. Elle ne s'intéresse qu'à l'origine biologique du matériel à extraire Tampons Il n'a pas de rôles propres à jouer pendant l'extraction : il sert juste à empêcher que la molécule se dénature pendant l'extraction. Il doit être adapté à la technique d'extraction et de purification utilisée. Il doit répondre à des exigences caractéristiques de la molécule à purifier : pH, force ionique . appropriés à la molécule. [...]

[...] Les molécules sont séparées en fonction de leur charge puis après migration les anticorps sont séparés sont déposés dans une gouttière creusée dans le gel heures après les anticorps ont diffusés et lorsqu'un anticorps rencontre son antigène, il se forme un complexe insoluble (un arc de précipitation blanchâtre). Electrophorèse capillaire Le gel d'électrophorèse se situe à l'intérieur d'un capillaire de silice. Les vitesses de migrations des molécules sont très rapides. Le volume de l'échantillon est très faible. Cette technique peut séparer des protéines ayant un seul acide aminé de différent. Révélation après électrophorèse On n'a pas besoin de révélation si la molécule est colorée. Directement dans le gel. [...]