Optimisation de l'extraction des protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae en vue de l'étude de son phosphoprotéome

Résumé du document

La levure de boulanger « Saccharomyces cerevisiae » est un champignon eucaryote unicellulaire et microscopique qui se multiplie par bourgeonnement ; elle est largement étudiée en biologie cellulaire et moléculaire. Cet organisme représente un système expérimental qui procure de nombreux avantages, à savoir la facilité à le manipuler en laboratoire, et ses hautes capacités de se multiplier. De ce fait, cette levure est devenue un des organismes eucaryotes les plus étudiés et les mieux connus (...)

Extraits

[...] Tableau 2 : Liste protéines identifiées d'un gel 1D de la levure sigma Aldrich Résultats MASCOT pour la levure Sigma Aldrich. Gel Enolase 2 Mascot Search Results User : adil Email : Search title : MS data file : 10%\2-1.txt Database : SwissProt 53.2 (272212 sequences; 99940143 residues) Taxonomy : Saccharomyces Cerevisiae (baker's yeast) (6162 sequences) Timestamp : 10 Jul 2007 at 15:49:22 GMT Top Score : 84 for ENO2_YEAST, Enolase 2 - Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast) Triosephosphate isomerase Mascot Search Results User : adil Email : Search title : MS data file : 10%\7-2.txt Database : SwissProt 53.2 (272212 sequences; 99940143 residues) Taxonomy : Saccharomyces Cerevisiae (baker's yeast) (6162 sequences) Timestamp : 10 Jul 2007 at 16:03:55 GMT Top Score : 51 for TPIS_YEAST, Triosephosphate isomerase - Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast) Gel 12% : Triosephosphate isomerase Mascot Search Results User : adil Email : Search title : MS data file : 12%\5.txt Database : SwissProt 53.2 (272212 sequences; 99940143 residues) Taxonomy : Saccharomyces Cerevisiae (baker's yeast) (6162 sequences) Timestamp : 10 Jul 2007 at 16:34:27 GMT Top Score : 70 for TPIS_YEAST, Triosephosphate isomerase - Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast) V-2-C Couplage nanoLC-FT L'analyse de la bande 2 du gel en couplage nanoLC-FT a permis de mettre en évidence la composition complexe en peptide issue de la digestion trypsique de plusieurs protéines de masse moléculaire proche. [...]

[...] Leur rôle est d'utiliser les sucres mis à la disposition de la levure pour produire de l'énergie et permettre ainsi à la cellule d'assurer sa croissance. IV- Techniques d'extraction. Les différentes méthodes employées pour la préparation des lysets des cellules de levure sont : IV-1- Autolyse. La méthode la plus ancienne est l'autolyse, la suspension de levure est mélangée à du toluène (ou aux composés tels que l'hydroxyde d'ammonium) et incubée à la température ambiante pendant 24-48 h. Le toluène empêche la croissance bactérienne et perméabilise la membrane de levure. [...]

[...] Yeast 15(10B): p. 1001- Wyber, J.A., J. Andrews, and A. D'Emanuele, The use of sonication for the efficient delivery of plasmid DNA into cells. Pharmaceutical Research p. 750- Knorr, D., K.J. Shetty, and J.E. Kinsella, Enzymic lysis of yeast cell walls. Biotechnology and Bioengineering 21(11): p. [...]

[...] Dans une première partie nous nous sommes intéressés à optimiser un protocole pour l'extraction des protéines totales de la levure Saccharomyces cerevisiae commerciale par des billes de verre. Dans la deuxième partie nous intéressant à extraire et caractériser par spectrométrie de masse MALDI-TOF les protéines de la levure sur un gel 1-D. Généralités. La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae est un champignon eucaryote unicellulaire et microscopique qui se multiplie par bourgeonnement ; elle est largement étudiée en biologie cellulaire et moléculaire. [...]

[...] A la fin de l'IEF, on place les strips successivement dans deux bains d'équilibration (tampon de réduction et tampon alkylation) pendant 15 min, puis on dépose les strips au dessus du gel et on lance la deuxième dimension SDS-page dans un système Ettan DaltsixTM (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) contenant le tampon RUN 1 X dans la cuve du bas et dans la cuve du haut le tampon RUN 2 X (tampon 10X : SDS de Glycine de Tris base). V-3 Coloration au bleue de coomassie. Les gels sont tout d'abord fixé dans une solution à 50% d'éthanol acide acétique pendant une nuit. Les gels sont ensuite mis dans une solution d'incubation d'éthanol et sont coloré pendant 3 jours d'éthanol de sulfate d'ammonium d'acide acétique de bleu de coomassie G 250). Apres on décolore les gels pendant une journée. V-4 Image du gel. [...]