Expression et localisation de Hox d11 ET fgf 8 dans des embryons de souris par hybridation in situ

Résumé du document

L'hybridation in situ est une technique bien connue permettant de visualiser les domaines d'expression de certains gènes. Dans le cadre de notre expérimentation, elle a été réalisée à l'aide de ribosondes complémentaires des séquences d'ARN codant pour deux protéines qui sont FGF8 et HoxD11.

FGF8 (fibroblast growth factor) codé par un gène jouant un rôle important dans le développement du mésencéphale, des yeux et des membres. Nous avons pu observer qu'il était exprimé au niveau de l'isthmus ainsi qu'en partie postérieure des bourgeons des membres. Ceci confirme bien le rôle de ce gène dans le développement embryonnaire (...)

Extraits

[...] Ceci confirme bien le rôle de ce gène dans le développement embryonnaire. La seconde protéine est HoxD11, qui est codée par un gène ayant un rôle important pour la détermination de l'identité cellulaire le long de l'axe antéropostérieur et ceci chez les vertébrés. Nous avons vu qu'elle devait s'exprimer quand à elle au niveau des bourgeons des membres. Il existe donc une co-expression de ces deux protéines qui laisse imaginer la possibilité d'une régulation de l'expression de l'une par l'autre. [...]

[...] Elle présente des avantages tels que sa réalisation sur des embryons entiers donnant une meilleure visualisation des domaines d'expression de chaque protéine. La RT-PCR a pour principe d'amplifier une matrice ARNm et d'obtenir l'ADNc après transcription inverse, permettant alors de connaitre la quantité d'ARNm et par la suite celle des protéines présentes sur le lieu de prélèvement. Néanmoins, elle ne peut pas se faire sur un embryon entier ce qui diminue la précision de localisation des domaines d'expression protéique. C'est l'une des raisons pour laquelle nous n'utiliserons pas cette technique. [...]

[...] Biologie du développement, Jonathan Slack Paris, février 2004, Edition De Boeck Biologie du développement, Les grands principes, Lewis Wolpert et al, Paris Edition Dunod Signalling by FGF8 from the isthmus patterns anterior hindbrain and establishes the anterior limit of Hox gene expression December 1999, MRC Brain Development Programme, Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, New Hunt's House, Guy's Hospital Campus, London SE1 9RT, UK 4. The mouse Fgf8 gene encodes a family of polypeptides and is expressed in regions that direct outgrowth and patterning in the developing embryo, Philip H. Crossley and Gail R. Martin, Department of Anatomy and Program in Developmental Biology, School of Medicine, University of California at San Francisco Cours Master V.Blanquet http://ist.inserm.fr/basisateliers/atel129/morel.pdf Visualisation de l'expression de fgf8 par hybridation in situ. a. utilisation de la sonde sens: absence de marquage spécifique. b. [...]

[...] Matériel et méthode Matériel biologique Des embryons de souris sont récupérés à partir de femelles gestantes suite à un accouplement contrôlé. Ils sont disséqués dans du PBS pour éliminer le placenta et les enveloppes embryonnaires. Par la suite, ils sont fixés pendant une nuit dans du paraformaldéhyde (PFA à 4%).Après rinçage, ils sont déshydratés dans du méthanol. Réhydratation : Les embryons sont réhydratés dans des concentrations décroissantes de méthanol. Puis ils sont blanchis par du peroxyde d'hydrogène avec pour tampon du PBT. [...]

[...] En ce qui concerne le gène hoxd11, son expression est localisée au niveau des bourgeons des membres. Malheureusement, les résultats ne correspondent pas à nos attentes. En effet, lors de l'hybridation in situ, la sonde ne s'est pas fixée sur les ARNs voulus. Nous retrouvons donc une coloration aspécifique, s'apparentant au neuropore antérieur. C'est par ces colorations spécifiques et aspécifiques que nous avons pu déterminer si les sondes dans chaque embryon étaient sens ou anti-sens insérées. Discussion Chez la souris les gènes Hox sont au nombre de quatre ensembles ce qui représente environ 39 gènes différents. [...]