Présentation de la PCR

Résumé du document

Exposé extrait d'un rapport de stage réalisé au cours d'études en BTS Analyses Biologiques. Il présente la PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) appliquée ici, aux bactéries à partir de leur ADN, extrait au préalable. Par des schémas simples, on peut comprendre rapidement le principe de cette réaction, celui de l'extraction d'ADN et visualiser l'analyse des résultats.

Extraits

[...] Réaction de Polymérisation en Chaîne PCR I. Principe de la PCR II. Protocole de la technique de PCR 1. L'extraction d'ADN 2. La PCR 3. L'amplification 4. L'électrophorèse en gel d'agarose 5. Sécurité I. Principe PCR (Polymerase Chain Réaction) La PCR est une méthode qui permet d'obtenir rapidement une quantité importante et exploitable d'un segment précis d'ADN, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant. [...]

[...] Protocole 1. L'extraction d'ADN Suite au schéma d'isolement de Vibrio cholerae présenté en Annexe on a obtenu une souche de Vibrio cholerae conservée dans un enrichissement de bouillon cœur cerveau à 10% de glycérol. On réalise alors, à partir de ce nunc conservé à un isolement sur Gélose Nutritive à de NaCl que l'on incube à 37°C pendant 24 heures afin de procéder à l'extraction d'ADN. Le protocole d'extraction de l'ADN est présenté en Annexe 2 et concerne uniquement l'ADN génomique des bactéries. [...]

[...] On peut ainsi réaliser la lecture des gels. Cela consiste à repérer la présence des bandes amplicons) qui apparaissent sous éclairage UV à 254nm. Mode Opératoire Préparation du gel d'agarose Les gels d'agarose utilisés sont composés de d'agarose standard EII-0 (SIGMA). Ainsi, pour un petit gel, on pèse 1,2 g d'agarose auxquels on ajoute 150mL de Tampon TBE 0,5X (Tris base, acide Borique, EDTA), contre 2 g d'agarose auxquels on ajoute 250mL de Tampon TBE 0,5X pour un grand gel. [...]

[...] Cependant, cela nécessite de connaître une partie de la séquence nucléotidique à copier. La PCR s'effectue en plusieurs cycles, chacun étant constitué de trois phases présentées en Annexe 1 : Phase 1 : Dénaturation à 95°C A cette température, les liaisons faibles (liaisons hydrogènes) qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN. Phase 2 : Hybridation à 40-65°C L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. [...]

[...] Sécurité et Gestion des déchets Le Bromure d'EThidium est un produit chimique très nocif. En effet, ce colorant est très cancérigène c'est pourquoi le manipulateur doit mettre des gants avec talc et le manier avec une grande vigilance. Tous les déchets qui ont été en contact avec le BET sont éliminés avec précaution. Les déchets liquides comme le bain de coloration et la première eau de rinçage sont éliminés dans la bonbonne rouge. Les déchets solides tels que les gants, le gel d'électrophorèse, les papiers absorbants sont éliminés dans le bac jaune. [...]