L'arginine kinase extraite de muscle de homard

Résumé du document

Etudes des paramètres cinétiques de l'arginine kinase de homard après extraction et purification sur colonne d'affinité en présence de deux substrats (ATP et arginine) dans le cadre d'un TP d'enzymologie.

Extraits

[...] À noter que la piste de la troisième fraction comprend une deuxième bande de MM d'environ 18000 Da et dont la nature reste inconnue. Tableau de purification Pour pouvoir étudier l'AE, une gamme de Bradford est nécessaire pour déterminer la quantité de protéine présente dans les fractions et une gamme de phosphore selon la méthode Briggs pour connaître la quantité de phosphore (quantité de produit formé) dans les tubes réactionnels y = 0,0236x - 0,0002 Absorbance R2 = y = 0,0082x - 0,0031 R2 = 0,9901 Absorbance quantité de BSA (µg) Quantité de P (µg) Figure 5 et 6 : courbes d'étalonnage des gammes de BSA et de phosphore (λBSA = 595 nm ; = 660 nm). [...]

[...] Ce profil d'élution permet d'établir le Kav de l'AK selon la formule : Kav = (VE-V0)/(VT-V0). Par rapport aux Kav et aux MM des protéines témoins, il est possible de tracer une courbe d'étalonnage permettant de déterminer mathématiquement la MM de l'AK Kav Log(MM) 0,15 y = -0,8492x + 4,0047 R2 = 0,9994 Figure 2 : Courbe d'étalonnage des protéines témoins passées sur la colonne. (Équation de droite Kav=f (log MM) et permettant de déterminer la MM de l'AK. MM protéines témoins : Myoglobine 17000, Anhydrase carbonique 29000, Ovalbumine 43000. [...]

[...] Pour cela, il est plus judicieux d'utiliser les courbes 1/Vi= pour avoir plus de points 1/Vi - 1/[ATP] y = 0,0731x + 0,1216 y = 0,1151x + 0,0625 y = 0,1188x + 0,0331 y = 0,1138x + 0,0224 [Arg] 0,5mM [Arg] 1mM [Arg] 2mM [Arg] 4mM [Arg] 8mM y = 0,0417x + 0,2449 Figure 9 : Représentation de Lineweaver Burk de 1/Vi (nkatal-1) en fonction de 1/[ATP] Yo -0,05 - 1/[Arg] Xo 0,2 y = 0,1197x + 0,0042 R2 = - - y = -1,1301x - 0,0165 R2 = 0,9934 1/[Arg] Figure 10 et 11 : Graphiques secondaires avec Y0 correspondant à l'ordonnée à l'origine des droites de la figure 9 et X0 correspondant à leur abscisse quand Y tend vers 0. Y0 = 1/Vm + KMArg/Vm d'où d'après l'équation de droite, Vm est égal à 238 nkatal et KMArg est égal 28,49 mM. X0 = -KMArg/KMATP 1/KMATP d'où d'après l'équation de droite KMATP est égal à 60,6 mM. [...]

[...] Le broyat est centrifugé 20 min. à 7800g, et le surnageant est récupéré (fraction F1). Une précipitation fractionnée par (NH4)2SO4 est effectuée jusqu'à 75% de saturation afin de relarguer préférentiellement l'AK qui est récupérée lors d'une deuxième centrifugation dans les même conditions que précédemment. Le culot obtenu est re-suspendu dans 6mL de "tampon colonne" (fraction F2) sous agitation magnétique. Le surnageant est utilisé afin de doser la concentration des protéines non précipitées par les sels (technique colorimétrique de Bradford). 4mL de la fraction F2 sont déposés sur colonne ULTROGEL AcA 54, élution à 1mL.min-1 (collecteur 3mL/fraction ; papier chromatogramme 6cm/heure). [...]

[...] La préparation des échantillons comprend leur dénaturation par un mélange dénaturant 2X, chauffés à 100°C durant 5 minutes. Chaque dépôt comprend 20µL de produit à 1mg.mL-1 chacun. Le volume de protéines témoins déposé est de 10µL (mélange de protéines de masses moléculaires connues : BSA [67000], Ovalbumine [43000], Inhibiteur de la trypsine [20100] et Lysozyme [14300]). L'analyse de l'activité enzymatique de l'AK est effectuée par dosage indirect par mesure de la quantité de phosphate libéré après hydrolyse acide de l'arginine- formé au cours de la réaction enzymatique (méthode de Briggs). [...]