La détection des acides nucléiques

Résumé du document

Fiche de révision de Biologie niveau Licence sur la détection des acides nucléiques. Qu'est-ce qu'une sonde ? Quelles sont les différentes stratégies de marquage ? Qu'est-ce que l'hybridation moléculaire et comment l'utilise-t-on ?

Extraits

[...] Dépend de la composition en base de l'ADN (plus il est riche en + le Tm est élevé), du mileu la force ionique est élevée, + le Tm est élevé). La présence de Formamide permet de diminuer le Tm. Effet hyperchrome = augmentation de l'absorbance UV observée lors de la fusion des brins. Renaturation Dénaturation réversible et spécifique (ne concerne que les molécules complémentaires). La cinétique d'hybridation dépend de la température et de la quantité de sonde et de cible. [...]

[...] Marquage d'un acide nucléique in vitro. Agent de marquage 1er type utilisé historiquement : radioactivité. Elément radioactif ( Libère des particules en se désintégrant ( Se caractérise par le type de particule émise ( Se caractérise par sa vie On utilise plus particulièrement : - le P32 : ( vie de 15 jours ( Émet des particules de type β (assez énergétique) Avantage : traitement des déchets facilité Inconvénient : sonde à utiliser immédiatement - le S35 ( vie de 2 mois ( Émet des rayons α (moins énergétiques donc moins dangereux mais moins facilement détectables) Le marquage radioactif est le marquage ayant la meilleure sensibilité ( Détection des particules émises par radioactivité - Méthode d'autoradiographie : Impression d'une pellicule argentique par les particules émises - Méthode de comptage (compteur à scintillation) Comptage du nombre de photon émis par unité de temps (=nombre de désintégration) Autres méthode de marquage : Coloration : introduction d'une enzyme dans une solution d'ADN qui clive un substrat et révèle une couleur. [...]

[...] Au contact du HRP, le luminol placé dans la solution avec de l'eau oxygénée (H2O2) s'oxyde et libère un proton. Stratégie de marquage Stratégies de marquage aux extrémités - Marquage en 3' ( terminale transferase - Marquage en 5' ( T4 polymérase kinase marquage sur toute la séquence - Nick-translation : déplacement de coupure. Création d'une coupure ( DNAse I Agrandissement de la coupure ( Activité exonucléase de la Polymérase I Réparation des coupures ( activité polymérase de la Pol I + ajout de nucléotides dont 1 radioactif. [...]