Réalisation d'une microplaque de cristallisation d'une protéine

Résumé du document

Le but de cet exercice sera d'identifier les effets de la variation de deux paramètres : la concentration en agent cristallin et en protéine sur la formation de cristaux de lysozyme. Vous réaliserez un diagramme de phase du lysozyme sur une plaque de cristallisation. Pour finir, on pourra en déduire, par le nombre et de la taille des cristaux, les concentrations en agents cristallins et en protéines idéales pour leur formation (...)

Extraits

[...] Température, poussières Quels autres paramètres pourriez-vous proposer pour la réalisation de cette expérience ? [...]

[...] En principe tout devrait être cristallisable, mais il n'existe pas de recette systématique. C'est donc par méthode empirique, en faisant varier divers paramètres susceptibles d'influencer la formation de cristaux (concentration de la macromolécule, concentration et nature de l'agent précipitant, température, pH, additifs, méthode de cristallisation utilisée) que l'on peut déterminer les conditions optimales permettant de générer un cristal à partir d'une molécule soluble Matériel nécessaire 1 pipeteur Rline (0-250 µl) 1 boîte de cônes (0-200 µl universel) 1 plaque 96 puits à fond rond format SBS 1 microplaque Greiner (plaque de cristallisation) fond plat format SBS et son film protecteur Les plaques de cristallisation sont constituées de quatre logements par puits : un logement de grand volume (200µl) pour recevoir la solution de cristallisation. [...]

[...] S'il reste du temps refaire le même protocole en essayant d'affiner les gammes de concentrations au plus proche des conditions optimales de cristallisation. (changez simplement la solution mère et ne pas réécrire le script) 9 Questions à traiter pour le compte rendu de TP. Quelles sont les domaines d'applications de la cristallisation ? Optimisation des propriétés cristallines pour une diffusion contrôlée de l'hormone (combinaison de variant) Quelles sont les caractéristiques géométriques d'un cristal de lysozyme ? Quelles sont les autres facteurs qui peuvent influencer la formation de cristaux lors de cette expérience et que proposez vous pour y remédier ? [...]

[...] - 1 µl de protéine selon la gamme de concentrations précédemment réalisée sur la plaque 96 puits sur les lignes Distribuez en premier 123 µl de solution cristallisante dans tous les puits de la colonne 1. Sans changer de cône, prélevez 1 µl de solution cristallisant de ces puits pour les déposer dans les cupules correspondantes. Lavez le cône entre chaque colonne dans les puits B1 { C1 remplies d'eau déminéralisée de la plaque deepwell. Déposez le lysozyme à partir de la gamme de concentrations préalablement préparée dans la plaque 96 puits. [...]

[...] Schématiquement, l'évolution de l'état liquide vers l'état du cristal peut être décrite sous forme d'un diagramme de phase. Ce diagramme met en scène l'effet de la variation de deux facteurs environnementaux (par exemple la concentration en agent cristallin et concentration en protéine). Sur ce diagramme, les cristaux de tailles et de qualités qui permettrons d'effectuer des analyses secondaires se trouvent dans la zone métastable. En effet, si la saturation devient trop importante, on observe de nombreuses nucléations mais les cristaux n'ont pas le temps de se former. [...]