Cours de biochimie des enzymes PACES (première année de médecine)

Thèmes abordés

Cours de biochimie des enzymes PACES, protéine, cinétique enzymatique, activité enzymatique, enzymes

Résumé du document

- Réactions biochimiques
. Réactions chimiques avec dénominations diff :
Oxydo-réduction (++) = hydrogénation, déshydrogénation, hydroxylation.
Substitution (++) = transfert.
Addition = hydratation / Elimination = déshydration.
Transposition = isomérisation, épimérisation.
Réactions acide/base = solutions tampons, catalyse chimique.

Extraits

[...] ou nom du substrat+ase (saccharase, uréase), ou nom substrat+tranformation réalisée+ase (lactate déshydrogénase) Numérotation conventionnelle = code à 4 chiffres W.X.Y.Z W = réaction enzymatique (de 1 à ex : 3 pour hydrolase) X = substrat général impliqué (ose, peptide) Y = substrat spécifique ou coenzyme (liaison O ou S glycosidique, -ase à sérine . [...]

[...] [ ET ] Vitesse formation ES = vitesse disparition ES K M S ] T ] = avec KM constante de Michaelis ] [ES ] ] Equation finale de Michaelis-Menten : v = v max . [...]

[...] ENZYMES Introduction Réactions chimiques Molec substrat + molec réactif (détermine réaction nucléophile ou électrophile) 4 types fondamentaux + 2 spécifiques Addition A + B C = sur double ou triple liaison Elimination A C + B = création d'une liaison multiple Substitution A + B C + D = remplacement Transposition A B = déplacement d'atomes Oxydo-réduction (nbre d'oxydation du C : pour C-H pour pour Oxydation = nbre d'oxydation augmente, élément oxydé, élément est réducteur, perte d'eRéduction = nbre d'oxydation diminue, élément réduit, élément est oxydant, gain d'eRéactions acide-base Réactions biochimiques Réactions chimiques avec dénominations Oxydo-réduction = hydrogénation, déshydrogénation, hydroxylation Substitution = transfert Addition = hydratation / Elimination = déshydration Transposition = isomérisation, épimérisation Réactions acide/base = solutions tampons, catalyse chimique Condensation cyclisation = A + B C + H 2O = substitution (sauf pour liaisons hémi-acétals = addition) Hydrolyse = coupure par H2O des liaisons des polymères (esters pour acides nucléiques, amides pour peptides, acétals pour osides), substitution Nécessité des enzymes (ex : une molec d'enzyme peut hydrater 105 molec de CO2 par seconde) Vitesse des réactions compatibles avec la vie = facteur moyen d'accélération de 103 à1012 Adaptation de la qté de produit obtenu par unité de temps (régulation enzymes) II] Définition = Macromolécule de nature protéique produite par les cellules, qui assure la fonction de catalyseur biologique et qui a une spécificité d'action élevée Protéine Propriétés = structures II, III et IV, sensible à la et au pH, changement conformationnel Composants = apoenzyme (partie protéique) + éléments ou cofacteurs associés (ions métalliques, coenzymes, structure polycyclique=hème) hétéroprotéines Métallo-enzymes = liaisons fortes de coordinance catalyse + stabilisation Enzyme à coenzyme = liaisons covalentes, idispensables pour réaction enzymatique Catalyseur = substance qui augmente la vitesse d'une réaction sans en modifier le bilan thermodynamique Propriétés = modifie seulement conditions cinétiques, dose infime, régénéré identique à lui-même, n'apparaît pas dans équation bilan Profil énergétique des réactions Passage par un état de transition = complexe activé = instable, NRJ plus élevée que réactifs ou produits Energie d'activation ΔΕ = NRJ absorbée par réactifs pour passer à l'état de transition puis réaction peut se faire à partir de cet état de transition = si élevée réaction lente / si faible réaction rapide Sommet énergétique = vitesse de la réaction (relation d'Arrhénius) Effet du catalyseur = diminue NRJ d'activation complexe activé ou une réaction remplacée par 2 Types de catalyse = homogène ou hétérogène Applications aux réactions biochimiques = enzyme se combine au substrat pour former complexe ES = NRJ d'activation plus faible Enzyme (macromolécule) prépondérante dans le complexe (substrat=petite molec) Fonctionnement de enzyme = soit réacteur (extraction des enzymes et distorsion des liaisons), catalyseur (multiplication états intermédiaires) ou intermédiaire (accepte transitoirement éléments transférés) importance de l'état de transition Spécificité Double spécificité De réaction = chaque enzyme ne catalyse qu'un seul type de réaction De substrat = chaque enzyme agit exclusivement sur une classe de composés ayant une structure moléculaire comparable III] Classification des enzymes Réaction catalysée Oxydo-réductases Ared + Box Aox + Bred Transférases + B A + Hydrolases + H2O + Lyases A + B Isomérases A isoA Ligases A + B Transfert ou de H Transfert d'un gpe fonctionnel ou d'une molec sous forme d'un radical Coupure d'une liaison par H2O Addition d'un gpe fonctionnel sur liaison (coupure ou formation d'une liaison Transfert d'un gpe fonctionnel à l'intérieur d'une molec Formation de liaisons covalentes CX avec couplage à une réaction Coenzyme OUI OUI NON OUI OUI OUI Exemples Déshydrogénases, oxydases Phospho-transférase, glycosyl-transférase, acyl-transférases Estérases, glycosidase, peptidase, phosphatase Déshydratase, sur liaisons C=O ou C=N Epimérases, mutases Sur liaisons C-O ou C-N Nomenclature Nom usuel = traditionnel (trypsine, pepsine . [...]

[...] ) IV] Site actif = zone spécifique où se fixe le substrat et se déroule la réaction Caractères = part réduite du volume de l'enzyme, entité 3D, fissure ou crevasse, mise en oeuvre d'interactions faibles non covalentes avec le substrat, liaison stéréospécifique du substrat Structure du site actif = 2 parties au sens fonctionnel Site de liaison = reconnaissance et maintien du substrat par interactions faibles fixation ds zone privilégiée et orientation favorable pour réaction Site catalytique = aa ayant potentialités réactives (His, Asp, Glu, Arg, Lys, Tyr, Ser, Cys) participant au mécanisme réactionnel apport d'éléments réactifs pour catalyse Liaison enzyme-substrat = pas covalente, uniquement des interactions Interactions Ioniques = Asp, Glu, Arg, Lys, His Hydrogène = Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, Lys, Tyr, Trp Transfert de charge = Phe, Tyr, Trp Hydrophobes = Phe, Val, Leu, Ileu De Van der Waals liées à proximité des atomes = aa non spé (auxillaires) Acides aminés du site de liaison déterminent orientation substrat et spécificité enzyme Conséquences = dénaturation (plus d'activité enzymatique) + certains aa st indispensables pour assurer structure tertiaire ou autres fonctions (solubilité) mais pas pour contact avec substrat Modèles du site de liaison = tjrs liaison stéréospécifique Clé-serrure rigide (suppose que enzyme a une structure figée) Ajustement induit dynamique (enzyme change de conformation qd fixation substrat, suppose que enzyme a une structure flexible, assure déformation nécessaire du substrat pour le fragiliser) Exemples : hexokinase (conformation open/close), carboxypeptidase (clé-serrure) Fonctionnement catalytique : exemple des sérines protéases Hydrolases, sous classe des peptidases (coupent liaison peptidique) = trypsine + chymo-trypsine Spécificité = dpd de aa juste avant liaison coupée (trypsine après aa basique Lys ou Arg, site profond négatif / chymotrypsine après aa aromatique Phe ou Tyr ou Trp, site large hydrophobe) Mécanisme de catalyse = 3 aa impliqués (Asp,His,Ser), catalyse acide-base et par covalence, sérine 195 réalise coupure doit être activée (réarrangement liaisons hydrogène) Sérine activée coupure liaison covalente transitoire enzyme-substrat état intermédiaire 1er peptide libérér Intervention molec d'eau comme réactif His état intermédiaire 2nd peptide libéré Les 2 peptides résultants de coupure ne st pas libérés en même tps états intermédiaires Mise en évidence du site actif = composés chimiques très réactifs qu se fixent sur site catalytique et empêchent la réaction Réactifs de groupes = modifient une chimique qui ne peut plus intervenir dans liaison substrat ou catalyse Diisopropylfluorophosphate (DFP) agit sur alcool de Ser Pyrocarbonate d'éthyle (DEPC) agit sur N imidazole de His N-éthylmaléimide (NEM) agit sur thiol de Cys Substrat ou analogue du substrat marqué = réagit par gpement fonctionnel et se fixe de façon covalente dans site actif ex : marquage de His57 de la chymotrypsine, ATP (analogue substrat) Cinétique enzymatique recombinaison négligeable de E+P : Points importants = syst monosubstrat, pas de retransformation de enzyme sous 2 états E et ES Eléments généraux Vitesse de réaction enzymatique = qté de substrat transformée ou produit formée par unité de tps Phases de la réaction Etat pré-stationnaire = formation du complexe ES Etat stationnaire = ES constant, vitesse initiale définie par [ES]max et par début apparition de P Effet du produit Equilibre Effet de sur la vitesse initiale relation linéaire Effet de sur la vitesse initiale plus et plus courbe d'allure hyperbolique qui tend vers une asymptote vmax on définit constante de Michaelis KM pour laquelle vmax Equation de la vitesse en fonction de Phase stationnaire : Formation de max et E+P commence à apparaître recombinaison négligeable de E+P Vitesse d'apparition du produit : v = k2 lorsque tte l'enzyme est complexée avec substrat [ ES ] v = v max . [...]

[...] K M ] Signification de vmax et KM Vitesse maximale vmax Notion de saturation = E totalement sous forme ES, permet d'aborder k2 (kcat=vmax/[E]) constante catalytique correspondant au nbre de molec de S transformées par unité de tps et par molec d'E Mesure d'activité = si alors v = v max = k cat ] , vitesse proportionnelle à Constante de Michaelis K M = k [ E S ] k 2 = [ ES ] k1 k1 pour v=vmax/2 Constante de dissociation du complexe ES (mesure affinité de E pr K M = K D = K A Varie entre 10-2 et 10-8 valeurs courantes 10-3-10-4M Rapport k2/KM représente efficacité catalytique vmax et KM caractéristiques d'un couple enzyme-substrat donné Linéarisation Plusieurs possibilités de transformer l'équation de Michaelis-Menten pour avoir relation linéaire Représentation la plus courante = de Lineweawer et Burk = 1/v fonction de 1/S Intersection avec axe des abscisses = -1/KM Ordonnée à l'origine 1/v = 1/vmax Pente = KM/vmax VI] Régulation de l'activité enzymatique Activité enzymatique Aspects expérimentaux = conditions de mesure où la cinétique ne dpd que de mesure de Vmax mesure sur des tps courts, paramètres externes identiques Unités d'activité enzymatique Système d'unité international SI = katal (kat) = qté d'enzyme catalysant transformation d'1 mole de substrat par seconde Unité traditionnelle = unité internationale = qté d'enzyme catalysant transformation d'1 µmole de substrat en 1 minute 60 UI = 1 µkat Expression Activité enzymatique ds 1 solut° = exprimée par unité de volume, directemt proportionnelle à Activité spécifique = exprimée par unité de prot présentes dans le milieu Conditions physico-chimiques Température = 2 effets Sur l'activité = accélération de réaction chimique car augmentation des chocs entre molec Sur la stabilité = dénaturation de prot donc perte d'activité fonctionnelle combinaison des 2 effets courbe avec un maximum, bonne adaptation enzymes à (congélation) pH du milieu = 2 effets Sur l'activité = ionisation des aa du site catalytique modifie interactions avec substrat et condition de la catalyse acide-base Sur la stabilité = dénaturation de prot donc perte d'activité fonctionnelle courbe en cloche avec un maximum ou courbe avec un plateau sur une zone de pH Effecteurs chimiques Ions métalliques = enzymes activées par un métal associé à enzyme par liaisons réversibles Autres composés capables de se lier à l'enzyme et d'en modifier la vitesse accélération (activateur) ou ralentissement (inhibiteur réversible ou irréversible=inactivateur) Inhibition compétitive = même site pour S et I ] I empêche fixation de S et KM K ' M = K M KM augmente et vmax constante Ki Analogie structurale substrat/inhibiteur, équilibre peut être déplacé par excès de substrat Inhibition non compétitive = sites différents pour S et I I ne limite pas accessibilité de S sur site actif, pas de modif de K M mais enzyme incapable de ] catalyser la réaction, modif de vmax v ' max = v max / vmax augmente et KM constante Ki Liaison de I à E ou ES avec même affinité, complexes EI et ESI inactifs, équation de vitesse inchangée, ne dpd que de ES, diminuée de EI et ESI = facteur d ' inhibition Ki Inhibition irréversible ou suicide Inhibiteur = complexe covalent stable avec inactivation permanente Mécanisme = liaison inhibiteur-enzyme, modif de I (composé très réactif), inactivation enzyma par modif covalente d'un aa Exemples = aspirine inhibiteur suicide de cyclooxygénase, pénicilline de transpeptidase bactéries Régulation Régulation passive = liée à équilibre chimique Réactions conduisant à équilibre moyen Déplacement équilibre = disponibilité du substrat et/ou du CoE + utilisation du produit (si utilisation continue, déplacement vers la dte et inversement) Régulation active = module effet catalytique Qualitative (activité enzymatique) Sans modif structurale de enzyme = régulation cinétique, activité modifiée pdt présence signal, visualisée courbes cinétiques, cas plus fréquents = inhibition en début de chaîne par activation en fin de chaîne par S Isostérie = cinétique michaélienne = régulation au niveau site catalytique (inhibition compétitive par P vitesse formation d'un P adaptée à son utilisation) Allostérie = cinétique non michaélienne = fonctionnement coopératif, régulation au niveau site spé sous influence d'activateurs ou inhibiteurs 4 caractéristiques majeures = structure IV, courbe sigmoïde avec seuil, chgmt conformation sans perte activité, régulatrice importante Modèle concerté= modification affinité formes R et liaison coopérative (liaison de S favorise transition symétrie R-R ou T-T obligatoire, activateurs ou inhibiteurs modifient équilibre T R Modèle cinétique = modification vitesse, passage T R individuel et cinétique Activateurs et inhibiteurs se fixent soit sur site allostérique site liaison soit sur s.u régulatrice spécifique, favorisent ou non transitions Par modif structurale de enzyme Caractères = régulation ON/OFF, activité persiste après départ du signal, réactions rapides et régulées Modification réversible = par modif post-traductionnelle d'un aa de E (phophorylation, adénylation, méthylation) ex : récepteurs membranaires Modification irréversible = activation par protéolyse précurseur inactif proenzyme (zymogène), une seule fois pdt vie de système de protection (digestion, coagulation) Par association enzyme prot régulatrice Régulation ON/OFF, activité persiste pdt présence signal, rapide et régulée, tjrs réversible, activatrice ou inhibitrice Fonctionnement = augmentation Ca intracellulaire fixation sur calmoduline activation interaction avec enzyme diminution Ca désactivation état initial Quantitative (concentration enzymatique dans la cellule) = contrôle transcriptionnel Contrôle hormonal ou par des facteurs de croissance Activation de facteurs de transcription Induction ou répression de l'expression des gènes VII] Propriétés et importance des enzymes Isoenzymes = prot différentes catalysant le même réaction biochimique gènes composition en s.u répartition dans organisme ou fonctionnelles (affinité, prop immunologiques) ou comportement électrophorétique LDH : ac lactique ac pyruvique ou CH3-CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH + NADH + Utilisation médicale des enzymes Pathologies Diagnostic biologique Utilisation thérapeutique des enzymes Médicaments inhibiteurs d'enzymes Modif métabolisme cellulaire (viagra, antidépresseurs . [...]