Clonage et rôle des gènes

Thèmes abordés

Clonage d'un gène, rôle des gènes, données NGS, écosystèmes, ADN, empreintes génétiques, identification d'une espèce, biologie de la conservation, transfection, mutation

Résumé du document

On peut prendre l'exemple du clonage de la séquence codante du gène STAT5B, gène impliqué dans de très nombreux cancers des cellules hématopoïétiques. Il y a d'abord besoin de fabriquer une sonde (obtenir un fragment d'ADN physique)
N. B. Dans les banques de données, l'ADN est virtuel, aucune expérimentation n'est possible.

Extraits

[...] Exemple Kit Origine knock-out 1. séquence cible clonée dans pCas Guide Vector 2. Modèle de donneur ADN contenant une cassette Homologue ARMS et fonctionnelle 3.Apres cotransfection, incorporation dans le génome Exemple Kit Takara – introduction insertion/délétion Permet de faire des insertions et délétions ( Réparation par NHEJ Inactiver l'expression d'un gène par la voie de l'ARN interférence ARN interférence = Voie de régulation des gènes post-traductionnelle Un certains nombres de séquence non codante transcrite par la pol2 vont donner un ARN. [...]

[...] Applications 1. Stratégies de clonage d'un gène Un gène : toutes les séquences nécessaires à l'expression correcte d'une séquence codante 2 méthodes à utiliser : - PCR mais besoin de connaitre la séquence nucléotidique du gène - Banque d'ADNg ou d'ADNc à cribler (hybrider avec une sonde) a. A partir d'une séquence virtuelle Exemple : Clonage de la séquence codante du gène STAT5B, gène impliqué dans de très nombreux cancers des cellules hématopoïétiques (Besoin de fabriquer une sonde (obtenir un fragment d'ADN physique) NB : Dans les banques de données, l'ADN est virtuel, aucune expérimentation n'est possible. [...]

[...] coli sélection sur milieu plus ampicilline (pas de crible blanc-bleu) Témoin de ligation (plasmide seul digéré et relégué), comparaison nombre de clones (témoin/ligation) Contrôle si clone recombinant (prep ADN plasmide, digestion, électrophorèse) Problème, la protéine MOS1 va-t-elle être dans le même cadre de lecture que la MBP pour production de la protéine de fusion ? EcoRI est dans le cadre de lecture Purification de la protéine taggée et contrôle de son expression Purification par chromatographie d'affinité On met le plasmide dans la bactérie. Il y a un promoteur lac Z. il faut passer la protéine totale sur une résine d'amylose, la partie MBP+MosI se fixe à l'amylose Eluer avec du maltose en excès afin que MBP+MosI se décroche de la résine (protéine purifié Ajout de l'enzyme protéase pour que MBP se détache de MosI. [...]

[...] Remplacer le gène sauvage par le gène mute = knock-out par recombinaison homologue Exemple : Gène Hoxa2, impliqué dans le développement de la souris Ils ont remplacé quelques exons des souris du gène Hoxa2 Inactiver un gène par CRISP-CAS9 Induire une cassure double brin par CRISP-CAS9 de façon spécifique dans le gène à analyser Réparation par les mécanismes de la cellule On Induit une cassure db dans le gène qu'on veut muter, on laisse faire les mécanismes de réparation. Nouvelles ADN non homologue et « joining » ou ADN donneur a des zones homologues avec les brins cassés ( réparation de cassure double brin par NHEJ ou par recombinaison homologue Besoin d'une nucléase et un ARN guide : L'ARN guide est complémentaire (inverse complémentaire) a la zone qu'on veut couper. Il faut la séquence Pam au bout de la zone à casser pour arrêter la coupure. [...]

[...] Donnez la stratégie générale du clonage sous forme de schémas ou de quelques phrases, sachant que le cDNA de STAT5B a déjà été cloné dans le pGEMT mais on ne connait pas l'orientation du fragment Détaillez ensuite chacune des étapes du clonage en indiquant les témoins réalisés et les résultats attendus Matériel a disposition (ENT) - cDNA de STAT5B a déjà été clone dans le pGEMT (diapos 71-74) - séquences du cDNA de STAT5B - Sites absents : EcoRI, HindIII, XbaI et présents dans le multi site de clonage - Carte du Pcs2 rendre à la dernière séance de TD Faire rentrer l'ADN du plasmide pCS2 + -STAT5B dans les cellules eucaryotes en culture Transfection : Méthodes chimiques : Phosphate de calcium : - Incubation ADN+phosphate ajout de calcium - Précipité ADN + phosphate de calcium - Mise en culture - Sélection Liposomes : même structure en lipide que membrane cellulaire - Incubation du réactif lipidique dans une micelle - Ajout d'ADN qui rentre à l'intérieur de la micelle - Complexe ADN liquide sur cellule eucaryote - endocytose par la cellule pour que l'ADN rentre dans les noyaux Méthodes physiques : Electroporation : Application d'un champ électrique pour ouverture des pores de la membrane ou l'ADN peut rentrer dans les cellules Micro-injection (Contrôler l'expression du gène en cellules par western blot 4. Connaitre le rôle d'un gène a. [...]