Le clonage et la construction de banques d'ADN

Résumé du document

I) Les vecteurs de clonage

- construction moléculaire dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger et qui peut s'intégrer dans une cellule hôte où elle assurera le maintien et la réplication du fragment d'acide nucléique porté (...)

Extraits

[...] Un cycle lysogène : Intégration du matériel génétique au chromosome de la bactérie qui le transmet à ses descendants. Utilisation comme vecteur. L'ADN recombiné est empaqueté avec les protéines du phage. Le phage se réassemble seul et reconstitue les particules infectieuses. Obtention d'un grand nombre de plage de lyse correspondant à des phages recombinés Avantages et inconvénients. Avantages : o Grande efficacité de propagation dans les bactéries. o Multiplication de façon importante. o Possibilité d'insérer des fragments de 20 à 25 kpdb. Inconvénients : o Lyse de la cellule hôte. [...]

[...] FR : Génie Génétique Clonage et construction de banques d'ADN Les vecteurs de clonage. = construction moléculaire dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger et qui peut s'intégrer dans une cellule hôte où elle assurera le maintien et la réplication du fragment d'acide nucléique porté. ( Vecteur recombinant = vecteur + insert Le vecteur doit comporter : Une origine de réplication (pour se multiplier dans la cellule hôte) Un ou plusieurs sites de restriction (pour insérer les fragments étrangers) Des éléments de sélection (pour tester la présence de la cellule hôte. [...]

[...] o Manipulation plus complexe. Autres vecteurs de clonage. Les chromosomes artificiels. l'exemple du BAC : - Clonage de grands fragments d'ADN - Issu du facteur F de la bactérie. - Insertion de fragments de + de 100kb - Site d'insertion Hind III ou BamHI - Utilisé pour la cartographie et le séquencage. Les YACs (Yeast Artificial Chromosomes) - Insertion jusqu'à 2000 kpb. II) Les grandes étapdes du clonage dans un plasmide Préparation de l'insert et du vecteur Digestion par la même enzyme de restriction + déphosphorylation du vecteur pour maintenir sa linéarité. [...]

[...] Possède : Une origine de réplication Un gène de résistance à l'ampicilline Des sites de restriction concentrés dans le MCS (multiple Cloning Sites) Le gène LacZ (gène de la β-galacsidase) ( Lorsqu'on place les bactéries avec du Xgal (substrat chomogène) et de l'IPTG (qui permet l'expression du gène LacZ), on obtient des colonies bleues (qui contiennent un plasmide vide), et des colonies blanches (qui contiennent un insert). Avantages et inconvénients. Avantages : o Petite taille = facilité de manipulation o Grand nombre de copies dans la bactérie = forte amplification de l'insert o Systèmes de sélection efficaces. Inconvénients : o Insertion dans les bactéries difficile. o Impossibilité d'insertion d'insert de + de 10 kbp. Les bactériophages Le cycle du bactériophage. [...]