Le clonage d'un gène humain dans un plasmide bactérien

Résumé du document

Le clonage est le mode de reproduction le plus répandu dans le monde animal et végétal. Ce mécanisme est aussi utilisé en laboratoire : il permet d'obtenir des êtres génétiquement identiques. Le premier clonage d'une carpe fut réalisé en laboratoire en 1963.

D'autre part, une technique de biologie moléculaire permet d'isoler un fragment d'ADN par l'intermédiaire d'un vecteur de clonage appelé plasmide (ici "bluescript"). Il peut y avoir d'autres vecteurs de clonage comme le bactériophage lambda, cosmide, phage P1, BAC et YAC (...)

Extraits

[...] Le tube A contient de l'ADN issue de la digestion de lambda et le tube B de l'ADN issue de la digestion du plasmide pBluescript. Marqueur de taille Marqueur de taille Cette 2ème migration est obtenue après la digestion de l'ADN des bactéries. Ces bactéries proviennent du fait qu'on a isolé les clones positifs de la boite de pétri (expliquer plus loin) et qu'on les ait amplifié pour en produire des copies par ces bactéries. Sur cette seconde migration ont observe deux fragments du fait que notre ADN bactérien ait été digérer par deux enzymes différentes. [...]

[...] Le but de ce TP est de cloner des morceaux de l'ADN du phage dans le vecteur plasmide Bluescript. Comment obtenir un nombre important de clones en vue d'expériences ultérieurs ? Nous faisons migrer des fragments d'ADN produit pendant la digestion de l'ADN lambda et de l'ADN de plasmide Bleuscript par électrophorèse. L'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée pour séparer les acides nucléiques en fonctions de leurs tailles et de leurs charges électriques. La digestion a été faite par deux enzymes de restrictions : ECO R1 et Hind III . [...]

[...] La transformation est une étape nécessaire où on introduit le plasmide dans la bactérie. Les bactéries ont été préalablement incubé à 37°C avant de les étaler car c'est à cette température qu'elles fonctionnent le mieux et leurs laisser le temps de produire une enzyme, la β lactamase (enzyme qui détruit l'ampiciline : vu plus bas). On étale ensuite les bactéries (contenant le plasmide) sur les boites de pétries : de l'agar (extrait d'algues) dans lequel on a inclus du milieu nutritif, de l'ampiciline et un réactif chimique appelé X-gal. [...]

[...] On fait maintenant une digestion de l'ADN obtenue par les enzymes Eco R1 et Hind III. Puis pour finir on fait une analyse ultime par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments produits pendant la digestion précédente. La réussite de cette expérience de clonage dépend de la précision du déroulement du TP. Une rigueur à chaque étape est exigée : le respect des consignes de manipulations l'habileté à manipuler le matériel tel que les pipettes, les tubes Eppendof, les pipetmans les méthodes telles que la centrifugeuse, le tapotage, vortexer, l'électrophorèse . [...]

[...] Pour cela nous utilisons un tampon de digestion qui contient le nécessaire pour faire fonctionner les enzymes. La digestion permet de produire plusieurs fragments d'ADN que l'on va par la suite utiliser dans l'électrophorèse. Nous poursuivons par une autre digestion mais cette fois avec le plasmide (blueuscript), toujours avec les mêmes enzymes. Ceci va nous permettre de cloner les fragments d'ADN obtenu précédemment dans ce plasmide. Ces digestions se produisent à température du corps humaine) pour une meilleure activité enzymatique. Nous inactivons ensuite les enzymes de restriction pour qu'elles ne continuent pas à couper l'ADN. [...]