Principe de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Résumé du document

Ce document décrit de façon détaillée la technique de PCR (polymérisation en chaîne) utilisée couramment en biologie moléculaire. Ce texte explique le principe de la méthode, décrit la méthode étape par étape (avec des schémas détaillés), décrit les différents constituants (fonction, origine), l'histoire de la PCR (découverte, évolution de la technique) et donne une série d'exemples de son utilisation de façon courante dans les laboratoires.

Extraits

[...] Elongation des amorces par addition de dNTPs par la polymérase. Les produits de la première extension (cycle sont les brins d'ADN synthétisé d'après l'ADN original qui a servi de matrice. Ils n'ont pas de longueur définie car l'enzyme continue la synthèse du brin complémentaire jusqu'à ce qu'elle soit interrompue par le début du cycle d'amplification suivant. Cycle 2 : même étape A partir du 2ème cycle, on obtient des fragments amplifiés de la taille désirée Les produits d'extension du 2ème cycle d'amplification ont une longueur soit indéterminée, soit limitée, selon que le brin d'ADN qui leur a servi de matrice faisait partie de l'ADN original ou avait été synthétisé aux cours du 1er cycle. [...]

[...] A chaque cycle d'amplification, la température doit varier en fonction de 3 étapes à respecter. Chaque cycle comporte donc 3 étapes: 1. étape de dénaturation de l'ADN : par action de la chaleur il y a rupture des liaisons hydrogènes qui existent entre les bases complémentaires. Ceci a pour effet de dérouler la double hélice d'ADN et de séparer l'un de l'autre les 2 brins d'ADN étape d'hybridation ou d'annealing des amorces : elle consiste en l'hybridation des amorces sur chacun des 2 brins d'ADN préalablement séparés l'un de l'autre. [...]

[...] Ces polymérases peuvent être ajoutées au tube de réaction dès le début de la PCR. Il n'est donc pas nécessaire d'en rajouter à chaque cycle. La première enzyme, de ce type, utilisée en PCR fut la Taq ADN polymérase provenant d'une bactérie thermophile, le Thermus aquaticus, se développant à 70-75°C, isolée des sources chaudes du parc national de Yellowstone. Depuis, d'autres ADN polymérases ont été isolées à partir d'autres microorganismes Le développement de blocs chauffants automatisés programmables ou thermocycleurs ou encore appareils PCR permettant le passage automatique d'une température à l'autre au cours des cycles d'amplification. [...]

[...] -médecine légale et criminologie : recherche de paternité ou identification de coupables dans les affaires criminelles. Ces recherches peuvent s'effectuer sur l'ADN provenant du bulbe d'un simple cheveu, d'une goutte de sang, du sperme ou même de quelques cellules épithéliales (peau). Les fragments d'ADN amplifiés sont alors comparés entre le père et l'enfant supposé ou l'ADN retrouvé sur une scène de crime et un suspect. -en archéologie : la PCR est possible sur de l'ADN extrait de fossiles ou de momies. [...]

[...] Cependant, le rendement n'atteint jamais 100% et on considère, qu'après 30 cycles d'amplification, l'ADN cible est amplifié d'environ 106 fois. Voici les facteurs limitant l'amplification exponentielle de la PCR : -la diminution de la quantité d'enzyme disponible après plusieurs dizaines de cycles. -la diminution de l'activité de l'enzyme par la dénaturation thermique subie au cours des cycles d'amplification. -la tendance des ADN synthétisés à se réhybrider entre eux, quand ils deviennent nombreux plutot qu'avec les amorces, perturbant donc l'étape d'hybridation. [...]